一种抗生素nvp018中间体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明适用于生物制药和生物化工领域，尤其设及一种抗生素 NVP018中间体的分 离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物，临床主要用于器官移植的排斥反应 和自身免疫反应性疾病。目前临床上使用的有环抱菌素 A(cyclosporin A，CoA)、肾上腺皮 质激素等。运些药物缺乏选择性和特异性，长期使用会降低机体抵抗力而诱发感染或增加 肿瘤发生的机率。因此，开发新型免疫抑制剂具有良好的临床前景。
[0003] NVP018(式1)是链霉菌产生的一种新型大环内醋类抗生素，用于治疗乙型肝炎和 丙型肝炎病毒，目前正在临床试验阶段。与传统的的免疫抑制药物相比，NVP018具有独特的 作用机理，不仅能阻断细胞周期Gl阶段的T细胞增殖，而且能在不影响B细胞抗体合成的情 况下，阻断B细胞增殖。而服457(式2)和服496(式3)均是合成NVP018的中间产物。
[0004]
[0005
[0006] 目前HS457的分离纯化，已知有使用硅胶柱层析，洗脱溶剂为乙酸乙醋-甲醇，此方 法中纯度可达到85% W上的HS457收率很低；使用丙酬及环己烧为洗脱溶剂，溶剂使用量 大，成本高，总回收率可达到87 %，纯度达到80 % W上组分的收率仅有29.0 %，目前无产业 化的分离纯化报道。
[0007] 而关于服496的分离纯化方法，目前无报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服了现有技术的不足，提供一种收率高、成本低的抗生素 NVP018中间体的分离纯化方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种抗生素 NVP018中间体的分离纯 化方法，包括如下步骤：
[0010] 1)在链霉菌接种至发酵培养基中进行发酵培养2地后，加入底物FS45并分批加入 非极性大孔吸附树脂，底物终浓度控制在1.5~2.5mM/L，待发酵结束后，将所述树脂从发酵 液中分离；
[0011] 2)采用pH为2.0~3.0的酸性溶液对所述树脂进行冲洗过滤，去除杂质，而后用等 质量的乙腊溶液对所述树脂进行多次洗脱，合并洗脱液并进行浓缩得到第一浓缩液；
[0012] 3)调节所述第一浓缩液的抑至5.5~6.5,采用等体积的乙酸乙醋对所述第一浓缩 液进行萃取、过滤，合并萃取液，减压浓缩得第二浓缩液；
[0013] 4)硅胶柱层析纯化：
[0014] 41)将所述第二浓缩液经环己烧处理分层，下层料液通过二氯甲烧溶解，得到上柱 样品；
[001引 42)将硅胶通过二氯甲烧浸泡过夜后，匀浆湿法装柱，上样后，采用二氯甲烧-甲醇 梯度洗脱，合并洗脱液并浓缩，册LC检测跟踪，分别收集NVPO18中间体HS457、HS496的粗 品；
[0016] 丑:中.所沐的FS45结娩古九，
[0017]
[001引所述的NVP018的结构式为：
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[0024] 优选地，所采用的链霉菌菌种为购自Isomerase化erapeutics Ltd公司生产的 Streptomyces sp.BIOT-4746菌种。
[0025] 进一步优选地，步骤1)的具体实施过程如下：
[0026] 11)、一级种子培养
[0027] 将保存在甘油管内的菌种接入灭好菌的摇瓶培养基中，置于摇床，220r/min，27°C 培养36~4她，当抑达到5.2~5.4，口1￥^8%时，得到一级种子液；
[0028] 其中，摇瓶培养基为:甘油40g/L、大豆蛋白腺(A3)10g/L、麦芽提取物21g/L，pH控 制在7.0;
[0029] 12)、二级种子培养
[0030] 将400~800ml的一级种子液接入灭好菌的1000 L二级种子培养基中培养，培养溫 度24~27°C，溶氧量>30%，培养36~55h，当抑达到5.2~5.4，？1￥>20%时，得到二级种子 液；
[0031 ]其中，二级种子培养基同步骤11)中的摇瓶培养基；
[00创 13)、发酵培养
[0033]将二级种子液Wl~5%的接种量接种于灭菌好的25m3发酵培养基中培养，培养溫 度23~25 °C，P册.4~6.6，通气量1:0.8~1. Ov/v/min，揽拌，溶氧量> 30 %，在发酵2地时， 加入底物FS45并分批加入非极性大孔吸附树脂，至发酵结束；
[0034] 其中，发酵培养基组成如下：大豆粉45~55kg/m3,甘油55~65kg/m 3,憐酸二氨钟 0.8~1.2kg/m3，憐酸氨二钟0.8~1.化g/V鄉氨酸1.8~2.化g/V;
[0035] 发酵过程中补加甘油，使发酵过程中甘油浓度控制在25g/L~35g/L。
[0036] 优选地，骤1)中，所述树脂采用分批投加的方式加入到发酵液中，具体地，在发酵 液发酵24h时加入50%~65%的所述树脂;在发酵110~12化时加入剩余的所述树脂。
[0037] 进一步优选地，步骤1)中所述的树脂选自0101、^〇'-081、466別1*6乂4018树脂中 的一种或多种的组合。
[003引优选地，步骤4)中，HPLC检巧U、收集到HS457的粗品后，经合并、萃取、浓缩得到 HS457的固体。
[0039] 优选地，步骤4)中，册LC检测、收集到HS496粗品后，还可对其进行二次硅胶柱层 析，具体的：将二次硅胶柱层析所需的硅胶通过石油酸浸泡过夜，匀浆湿法装柱，取步骤4) 中所得的HS496粗品上样，采用石油酸-乙酸乙醋等度洗脱，合并洗脱液，并浓缩，HPLC检测 跟踪，收集服496样品，合并、萃取、浓缩得到服496油状固体。
[0040] 更进一步优选地，向得到的HS496油状固体中加入甲苯，揽拌离屯、，离屯、后再加入 环己烧进行打浆、过滤、干燥得到粉末状的HS496固体。
[0041] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0042] 1)本发明的分离提纯方法，在链霉菌发酵过程中，W分批补加的方式加入非极性 大孔吸附树脂，使树脂的回收率增加了 15~25 %，并且HS457的含量提高了 14.3 %，很大程 度上节约了成本；
[0043] 2)现有技术中使用硅胶柱层析分离服457,洗脱溶剂为乙酸乙醋-甲醇时HPLC检测 纯度大于85%的收率偏低，而使用丙酬-环己烧为洗脱溶剂时HPLC检测纯度大于85%的收 率仅有29.0%，总回收率为87%，并且溶剂使用量大，成本高;而本发明中利用硅胶柱层析 分离纯化服457，其洗脱溶剂为二氯甲烧-甲醇，HPLC检测其最高纯度可达到92 % W上，纯度 在85% W上收率可达到70%，样品总回收率可达到93% ;
[0044] 3)采用本发明的硅胶柱层析在分离纯化HS496时，册LC检测其最高纯度可达到 95 % W上，纯度在85 % W上的收率可达到70 %，样品总回收率可达到95 % ;
[0045] 4)经二次硅胶柱层析后，HS496为油状物，册LC检测纯度大于85%，本发明可将 HS496纯化为固体粉末状，收率为50%。
【具体实施方式】
[0046] 下面对本发明的技术方案作进一步的阐述。
[0047] 实施例1链霉菌菌种培养
[004引 菌种：Streptomyces sp.BI0T-4746(购自 Isomerase Hierapeutics Ltd公司）
[0049] A、一级种子培养
[0050] 将保存在甘油管内的菌种接入灭好菌的摇瓶培养基中，置于摇床，220r/min，27°C 培养36~4她，当抑达至化.2~5.4，PMV M8 %时，得到一级种子液；
[0051 ]其中，摇瓶培养基组分:甘油40g/L，大豆蛋白腺(A3) lOg/L，麦芽提取物21g/L，pH 7.0，121±2°C 灭菌 30min;
[0化2] B、二级种子培养
[0053] 将400~800ml的一级种子液接入灭好菌的1000 L二级种子培养基中培养，培养溫 度27°C，溶氧大于30%，培养36~50h，当pH达至化.2~5.4，PMV>20%，得到二级种子液；
[0054] 二级种子培养基同步骤A中的摇瓶培养基；
[0化日]C、发酵培养
[0056] 将二级种子液Wl~5%的接种量接种于灭菌好的25m3发酵培养基中培养，培养溫 度24°C，pH6.5，通气量1:0.8~1. Ov/v/min，揽拌，得到链霉菌发酵液，溶氧30 % W上时，开 始发酵；
[0057] 其中，发酵培养基组成：大豆粉50kg/m3，甘油60kg/m3，憐酸二氨钟Ikg/m 3，憐酸氨 二钟化肖/1113，心鄉氨酸化g/m3,121 ±2°C，灭菌30min。
[005引另配制质量百分比为60%的甘油置于储罐中，12rC灭菌30min，通过补加甘油，使 发酵过程中甘油浓度控制在25g/L~35g/L。
[0化9]实施例2
[0060] 大孔吸附树脂的第一次纯化
[0061] 在二级种子液接种到发酵培养基中发酵24h后，加入预处理好的IOt底物FS45和 1600kg非极性大孔吸附树脂，经110~12化培养，加入预处理并灭菌好的非极性大孔吸附树 脂900kg，此时服457含量可达175~185mg/L，继续培养至产物量不再增加，即为发酵结束。
[0062] 其中，底物FS45提前一天溶解在DMSO中，加入发酵罐后，其终浓度控制在21111/1;而 非极性大孔吸附树脂则提前用甲醇浸泡过夜，水洗去甲醇，12rC灭菌30min再加入发酵罐 中。另外，所选用的非极性大孔吸附树脂