一种磷脂酰乙醇胺n-甲基转移酶酶活力检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言本发 明提供了一种检测憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT，F^hosphatidylethanolamineN-methyltransferase，EC 2.1.1.17)酶活力的组合产品。
【背景技术】
[0002] 胆碱是一种强有机碱，是卵憐脂的组成成分，也存在于神经銷憐脂之中，是生命体 所需要的一种营养物质，胆碱对肝脏和脑的结构和功能、脂肪代谢及胎儿发育具有重要作 用。胆碱对脂肪有亲和力，可使脂肪W憐脂形式由肝脏通过血液输送出去，从而防止脂肪肝 的形成，有效保护和治疗酒精引起的肝纤维化，具有抗肝脂肪过氧化的作用，从而减少酒精 弓植的肝细胞调亡，调节肝细胞活性，降低肿瘤坏死因子的细胞毒性和增强白介素22保护 肝细胞的作用，同时胆碱还具有保护肌肉组织避免损伤的作用。胆碱对胎儿的发育至关重 要，它影响干细胞的增值和调亡而改变脑的结构和功能，同样胆碱缺乏会增加患神经管缺 陷的风险。
[0003] 人类体内胆碱可W部分来自于憐脂酷胆碱，憐脂酷胆碱是所有真核细胞的细胞膜 的基本组成成分。憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)是催化憐脂代谢途径中憐脂酷乙醇胺 N-甲基化反应的一种催化酶，在哺乳动物中该酶能够将S-腺巧酷甲硫氨酸的甲基基团 转移给憐脂酷乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)的N端，通过两个憐脂酷乙醇胺的 中间态物质憐脂酷N-单甲基乙醇胺(PME)和憐脂酷N，N-二甲基乙醇胺(PDE)，最终合成憐脂 酷胆碱(phosphatidylcholine,PC)。
[0004] PMET在肝外组织的活性极低，主要在正常的肝组织中表达，哺乳动物体内肝脏是 唯一的具有显著PEMT酶活力的器官。PEMT具有两种类型，分别是阳MTl和PEMT2,其中阳MTl 位于内质网的胞质一侧的表面，具有非常高的总PEMT活力，是肝脏中主要合成憐脂酷胆碱 的酶。PEMT2分布于线粒体相关的膜部分，据研究发现，PEMT2负责肝细胞20%-40%憐脂酷 胆碱的合成，已有的研究证明其基因表达与肝细胞的增值分裂呈负相关，增值快的细胞如 肝癌细胞、再生肝组织中PEMT2的表达量很低，正常肝细胞中PEMT的表达和活性都较高，研 究表明，PEMT基因敲除的小鼠患有脂肪肝，并且更易患化学诱导的肝癌。还有研究发现 PEMT2的过表达可W抑制重组质粒转染大鼠肝癌CBRH-7919细胞的增值并诱导细胞的调亡。
[0005] PEMT基因具有很高的多态性，目前已经鉴定出一百余个SNP，其中5465G一 A和744G 是已知的具有功能的SNP，能够影响蛋白的活性剂胆碱的需求及肌体的健康。非酒精性 脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是常见的慢性病之一，人群的发病率 高达25% ,NA化D可能会发展为肝细胞坏死、纤维化甚至肝硬化。PEMT基因中5465G一A的结 果是导致175位氨基酸由置换，从而引起部分编码PEMT活性缺失，运种基因多态性在NA化D 患者发生率相当于正常人的1.7倍，可W推断PEMT活性缺失与非酒精性脂肪肝的发病有直 接的关系，因此推测人类非酒精性脂肪肝与PEMT基因多态性有关。744G^C位于该基因的启 动子区，约有50个碱基位于雌激素反应元件区域内，744G^C可影响该基因的表达，通过雌 激素介导的PEMT基因的感应从而增加女性对胆碱缺乏的敏感性，有研究显示744CC与GG相 比增加了患乳腺癌的风险。
[0006]有研究显示帕金森病患者脑部额皮质的PEMT活力低于正常人，外源性增加 PME和 PDE后会显著增加脑部的甲基化水平，但在额皮质却没有得到任何修正，说明帕金森病与 阳MT的功能有关，有文献报道阳MT V175M与中国人群的散发型阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)相关。
[0007]还有研究显示，在小鼠体内缺少PEMT表达会导致高密度脂蛋白化igh density lipoproteins,HDL)量的降低W及极低密度脂蛋白（very low density lipoproteins, VLDL)和低密度脂蛋白（low density lipoproteins,LDL)量的升高，化DLW及LDL含量的升 高是动脉粥样硬化发生的危险因素。由此可见PEMT表达和活性的降低有可能是人类动脉粥 样硬化的诱导因素之一。
[000引目前PEMT酶活力的检测方法是放射化学法，即通过检测WS-腺巧-k (甲基-3H)-蛋氨酸为底物生成憐脂(phosphol ipids)所结合的[甲基-3H]的量，来测定阳MT的活性，运 种放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，不利于推广使用。
【发明内容】
[0009] 因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶 (PEMT，F^hos地atidylethanolamineN-methyltransferase，EC2.1.1.17)的酶活力检测方 法不易推广的问题，本发明的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的检测憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT，Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，EC 2.1.1.17)酶活 力的组合产品。采用该组合产品可W在半自动或全自动的分析检测设备上使用，而且检测 灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可W得到切实的推广使用。
[0010] 针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0011] 具体地，本发明提供一种检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品含有： S-腺巧-心甲硫氨酸(SAM)或生成S-腺巧-心甲硫氨酸的酶反应系统，所述生成S-腺巧A-甲 硫氨酸的酶反应系统包括=憐酸腺巧，甲硫氨酸和S-腺巧甲硫氨酸合成酶；甲基受体;S-腺 巧A-同型半脫氨酸水解酶(SAHase)。优选地，所述组合产品为试剂盒形式，其中各包含成 分为各自存在的试剂状态。
[0012]优选地，根据前述的检测阳MT酶活力的组合产品，其中，所述甲基受体为憐脂酷乙 醇胺类化合物。优选地，所述憐脂酷乙醇胺类化合物为憐脂酷乙醇胺(PE)或憐脂酷N-单甲 基乙醇胺(PME)。最优选为憐脂酷乙醇胺。
[0013] 更优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品还包括缓 冲液。所述缓冲液是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定6.5~ 10.0的范围中的试剂，它的存在可W有效的稳定憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶的催化反应的 pH值，并可W稳定憐脂酷乙醇胺N-甲基转移酶的物化性质，从而利于憐脂酷乙醇胺N-甲基 转移酶的酶活力的分析和检测。它包括W下实例但不限于运些实例：
[0014] 甘氨酸-氨氧化钢:pH 8.6~10.6
[0015] 巧樣酸/巧樣酸钢:pH 3.0~6.6
[0016] 憐酸氨盐/巧樣酸(盐）：抑2.2~8.0
[0017]憐酸盐:pH 4.9~8.2
[001引 2-吗嘟代乙横酸缓冲液(MES) :pH 5.5~6.7
[0019] 3-吗嘟丙横酸缓冲液(MOPS):抑6.5~7.9
[0020] 4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲液化E阳S):pH 6.8~8.2
[0021] Tris-盐酸:pH 7.1 ~8.9
[0022] 棚酸-棚砂缓冲液:pH 7.4~9.0
[0023] 己比妥钢-盐酸缓冲液:pH 6.8~9.6
[0024] 最优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸。
[0025] 再优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括:所 述组合产品pH范围为6.5~10.0，优选为7.5~8.9，最优选为8.5;所述组合产品含有所述缓 冲液为10~lOOOmmol/L，优选为25~lOOmmol/L，最优选为3〇111111〇1/1;所述甲基受体为0.002 ~10mmol/L，优选为0.05~0.5mmol/L，最优选为0.2mmol/L;所述S-腺巧-レ甲硫氨酸为 0.02~2mmol/L，优选为0.05~0.5mmol/L，最优选为0.1 mmol/l;及所述S-腺巧-1^-同型半脫 氨酸水解酶为0.01~100KU/L，优选为0.1~50KU/L，最优选为10KU/L。
[0026] 优选地，根据根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品还含有 试剂，所述试剂为油酸、胆酸盐、Tween 20、化ij35或牛横胆酸钢。优选地，所述试剂的体积 百分浓度为0.05-1 %。最优选为0.5 %。
[0027] 更优选地，根据根据前述的检测阳MT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品为干 粉或液体。
[0028] 再优选地，根据根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品为双 剂试剂或=剂试剂。
[0029] 具体地，前述的检测阳MT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括：
[00301
[0031] 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双 剂还是=剂，如下成分关系较为理想。
[0032] 因此，优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括： [00331
[0034] 最优选地，根据前述的检测阳MT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品抑为8.5， 所述组合产品含有所述缓冲液30mmol/L，所述甲基受体0.2mmol/L，所述SAMO. Immol/L，所 述S-腺巧-k同型半脫氨酸水解酶10KU/L。
[0035] 优选地，根据前述的检测PEMT酶活力的组合产