Mst4基因诊断及细胞治疗感染性疾病的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及MST4基因诊断及治疗败血症等感染性疾病 的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 过度炎症反应会对机体产生不利影响甚至引起死亡。Toll样受体（TLR)信号通路 在细菌感染和组织损伤中都发挥着关键作用。在多种病理条件下，如败血症，TLR信号通路 的素乱会导致过度炎症反应，对机体早场损伤。因而，免疫炎症和免疫耐受之间需要精细的 调控。在检测到病原相关分子模式后，多数Toll样受体会激活信号传递的中间分子TRAF6， 而后激活下游的NF-kB通路产生促炎细胞因子。因而TRAro的激活需要被精密调控W维持 免疫稳态。
[0003] TRAro是一个E3泛素连接酶，由有一个N端RING结构域，数个锋指结构域，一个卷 曲螺旋结构域和一个C端的TRAF结构域（TRAF-C)。TRAra与上游激活因子的结合模式与 TRAF家族其他蛋白不同，K63链的自身泛素化是其激活的关键因素。TRAro的卷曲螺旋结构 域和C端的TRAF结构域介导其自身寡聚，TRAF6进而与K63特异的E2泛素缀合酶化cl3/ Uevla或化cH7结合，发生非降解的K63位泛素化。泛素化的TRAro招募下游的信号分子 如TAB1/2和TAKl，进而激活IKK和NF- K B。目前为止，人们已发现了不同的调控因子可W 通过K63位去泛素化W及打破TRAro与化cl3AJevla，MYD88等相互作用分子的结合来调控 TRAro的功能。但TRAro是否存在泛素化W外的修饰影响其功能还不得而知。
[0004] MST4属于生发中屯、激酶GCKIII亚家族。该亚家族有S个成员，即MST4, MST3和 STK25。运=个激酶都有保守的激酶结构域，其C端结构域介导同源二聚或与接头蛋白的异 源二聚，但结构不尽相同。MST4是一个大小为55kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在膜腺、 胸腺、淋己细胞和外周血的粒细胞中高表达。GCKIII家族的其他激酶已被报道在TNF a诱 导的NF-K B信号通路中发挥功能，但MST4的生物功能目前还知之甚少。我们之前的研究 表明MST4参与细胞极性形成W及细胞生长，并在肿瘤抑制因子L邸1的下游憐酸化Ezrin。 此外接头蛋白M025直接与GCKIII家族激酶的激酶结构域结合，大大增强其激酶活性。最 近，研究又发现MST4是STRIPAK复合物中的一个激酶，在信号转导，细胞周期，细胞调亡、膜 泡运输和细胞迁移过程中发挥作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开MST4基因或其同源序列治疗感染性疾病的用途及其相 关药物，其中，MST4直接与TRAro相互作用，通过憐酸化TRAro抑制其自身泛素化并下调 NF- K B信号通路，抑制过度免疫反应。
[0006] 本发明首先公开了分离的MST4基因或其同源序列在制备或筛选感染性疾病治疗 药物，或者在制备感染性疾病诊断药物中的用途。
[0007] 较优的，所述感染性疾病选自败血症、细菌性频疾或追疾。
[0008] MST4基因的核巧酸序列在Genebank中序列号为NM_016542. 3的序列。
[0009] 优选的，所述MST4的同源序列为与Genebank中标号为NM_016542. 3所示序列的 核巧酸序列在确定的分子长度内，序列显示有至少约50%;优选至少约为75%;更佳至少约 为80-85% ;尤其佳至少约为90% ;最佳至少约为95-98%序列相似性的DNA序列。更优选 的，所述MST4的同源序列选自小鼠 MST4基因。
[0010] 所述MST4基因及其同源序列在制备感染性疾病诊断药物中的用途，是指将MST4 基因表达水平作为一项诊断指标应用于感染性疾病诊断药物的制备。
[0011] 所述MST4基因及其同源序列在制备或筛选感染性疾病治疗药物中的用途，是指 W MST4基因为目的基因，制备或筛选能上调该基因表达的药物。
[0012] 所述通过分离的MST4基因制备或筛选获得的感染性疾病治疗药物或者感染性疾 病诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肤、蛋白 或干扰慢病毒。
[0013] 所述感染性疾病治疗药物的施用量为足够改变人MST4基因的转录或翻译，或者 足够改变人MST4蛋白的表达或活性的剂量。
[0014] 采用前述感染性疾病治疗药物治疗感染性疾病的方法，主要是通过过表达MST4 基因，直接与TRAro相互作用并憐酸化TRAro的T463和T486,抑制其K63化链的自身泛素 化及下游信号通路的激活，调控过度免疫反应。具体的，治疗时，将能过表达MST4基因的物 质给药于患者。
[0015] 本发明第二方面公开了一种降低MST4基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：
[0016] a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与MST4基因杂交的核巧酸序 列；或者
[0017] b) shRNA，所述ShRNA中含有能够在严紧条件下与MST4基因杂交的核巧酸序列。
[0018] 进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共 同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与MST4基因中15-27个连续的核巧酸序列基本 相同。较佳的，所述第一链的序列与MST4基因中19-23个连续的核巧酸序列基本相同；更 佳的，所述第一链的序列与MST4基因中19、20或者21个连续的核巧酸序列基本相同。
[0019] 更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补 共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与MST4基因中的祀序列基本相同。
[0020] 优选的，所述MST4基因的祀序列含有SEQ ID N0:69~71所示的序列，具体的：
[0021] 5, -CAGCAAGTCGTTGCTATTAAAAT-3,（沈Q ID NO :69);
[0022] 5, -TTCACCTGTATTCTAGTAAATGT-3,（沈Q ID NO :70);
[0023] 5, -GCCTGGGATGCAGAATAATATAG-3,（沈Q ID NO :71);
[0024] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核巧酸；较佳的，长度均为 19-23个核巧酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核巧酸。
[0025] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (SiRNA)。 阳〇%] 更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :72~74所示，具体为：
[0027] 5' -GUCGUUCAGCAACGAUAAUUUUA-3,（沈Q ID NO :72);
[0028] 5, -AAGUGGACAUAAGAUCAUUUACA-3,（沈Q ID NO :73);
[0029] 5, -CGGACCCUACGUCUUAUUAUAUC-3,（沈Q ID NO :74);
[0030] 沈Q ID NO :72~74所示的SiRNA为W沈Q ID N0:69~71所述的序列为RNA干 扰祀序列设计的、针对MST4基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一 链序列互补，该SiRNA可W起到特异性沉默MST4基因表达的作用。
[0031] 进一步的，所述ShRNA包括正义链片段和反义链片段，W及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与MST4基因中15-27个连续的核巧酸序列基本相同。所述ShRNA经加工后 可成为小干扰RNA (SiRNA)进而起到特异性沉默细胞中内源MST4基因表达的作用。
[0032] 更一步的，所述ShRNA包括正义链片段和反义链片段，W及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与MST4基因中的祀序列基本相同。
[0033] 较佳的，所述正义链片段与MST4基因中19-23个连续的核巧酸序列基本相同；更 佳的，所述正义链片段与MST4基因中19、20或21个连续的核巧酸序列基本相同。
[0034] 进一步的，所述ShRNA的茎环结构的序列可选自W下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。优选的，所述茎环结构为 UUCAAGAGA。
[0035] 更进一步的，所述ShRNA的序列如SEQ ID NO:75~77所示，具体为： 阳03引 5' -GGCCGUCGUUCAGCAACGAUAAUUUUAGAGCUCUAAAAUUAUCGAAGCUGAACGACAAAAAC-3,（ 沈Q ID NO : 7巧；
[0037] 5' -GGCCAAGUGGACAUAAGAUCAUUUACAGAGCUCUGUAAAUGAUGUUAUGUGGAGUUAAAAAC-3,（ 沈Q ID NO : 76); 阳03引 5' -GGCCCGGACCCUACGUCUUAUUAUAUCGAGCUCGAUAUAAUAAGACGUAGGGUCCGAAAAAC-3,（ 沈Q ID NO : 77)。
[0039] ShRNA序列中的前两位为保护碱基，防止降解。 W40] ShRNA经酶切加工后可成为SiRNA,进而起到特异性沉默内源性MST4基因表达的 作用。
[0041] 编码本发明所述ShRNA的基因片段的慢病毒病毒载体含有SEQ ID NO. 69~71所 示的序列及其互补序列。 阳0创所述双链RNA的第一链或所述ShRNA的正义链片段与MST4基因中的祀序列基本 相同，所述MST4基因的祀序列即为SiRNA用于特异性沉默MST4基因表达时，被所述SiRNA 识别并沉默的mRNA片段所对应的MST4基因的片段。
[0043] 较佳的，所述MST4基因中的祀序列含有SEQ ID NO. 69~71所示的序列。 W44] 进一步的，所述MST4基因来源于人。
[0045] 本发明第S方面，公开了一种MST4基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分 离的核酸分子中的ShRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
[0046] 所述的MST4基因干扰核酸构建体可W是将编码前述MST4基因 ShRNA的基因片段 克隆入已知载体获得。进一步的，所述MST4基因干扰核酸构建体为MST4基因干扰慢病毒 载体。
[0047] 本发明的MST4基因干扰慢病毒载体是将编码前述MST4基因 ShRNA的DNA片段克 隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述MST4基因干扰慢病毒载体经过病 毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染组织细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶 切加工等步骤，最终获得所述SiRNA,用于特异性沉默MST4基因的表达。
[0048] 进一步的，所述基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可 被检测的标记物的核巧酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色巧光蛋白（GFP)。 !；00例进一步的，所述慢病毒载体可W选自：pLKO. l-puro、pLKO. l-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、pLKO. 1-Neo、pLKO. 1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、pLKO. l-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. I-Piiro-CMV-^评P635、pLKO. I-Piiro-UbC-^rboGFP' pLKO. 1-puro-UbC-Ta评P635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/Ue、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-lamins虹na、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSa-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0050] 本发明实施例具体列举了 W pLKO. I-EGFP为载体构建的MST4基因慢病毒载体。
[0051] 本发明分离的核酸分子可用于制备降低MST4基因表达的药物。 阳化引本发明的MST4基因 SiRNA可用于降低MST4基因表达。MST4干扰慢病毒载体则可 用于制备所述MST4基因 siRNA。当用作降低MST4基因表达的药物或制剂时，是将安全有效 量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，运 些都是熟练医师技能范围之内的。
[005引本发明第四方面，公开了一种MST4基因干扰慢病毒，由前述MST4基因干扰慢病毒 载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染细胞并产生 针对MST4基因的小分子干扰RNA，从而降低MST4基因的表达。
[0054] 本发明第五方面，公开了一种用于降低MST4基因表达的药物组合物，其有效物质 含有前述的分离的核酸分子，MST4基因干扰核酸构建体或MST4基因干扰慢病毒中的一种 或多种的组合。
[0055] 进一步的，所述药物组合物含有1~99wt%所述双链RNA、shRNA、MST4基因干扰 核酸构建体或MST4基因干扰慢病毒，W及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0056] 在制备运些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可 W胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可W是固体、半固体或液体 材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可W是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖 浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、薦糖、山