一种可同时检测四种弧菌的多重lamp方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测方法，具体设 及大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 大菱解弧菌(Vibrio scophthalmi)是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状，现已知该菌 是大菱解、牙解等重要经济鱼类的致病菌，病鱼症状为皮肤变黑、肝脏和小肠出血、并伴有 腹水和腹胀;创伤弧菌(V化rio vulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，主要分布于近海海 洋环境中，是水产养殖邮、蟹和牡颇等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌 之一；副溶血弧菌(V化rio化rahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多 种形状，广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌;鱼肠道弧菌 (Vibrio ichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌，呈杆状，两端纯 圆，散在或成双，无芽抱，可感染大菱解（ScophthaImusmaximus )、牙解（ParaIichthyS olivaceus)、石蝶化areius bicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损 失。
[0003] 目前，针对大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测技术主要是 PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于运些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁 琐、费时费力，很难推广应用。环介导等溫扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术 根据祀序列设计四条特异性引物，可W特异性识别祀序列的六个特定区域，在等溫条件下， 通过Bst DNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可W在1小时内对祀序列实现IO9倍的扩增，扩 增产物加入巧光染料SYBR Green I后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可W通过肉眼直接 观察。已经有关于创伤弧菌和副溶血弧菌的单重LAMP检测方法，但多重LAMP比单重LAMP更 加快速、简便等特点，适合基层养殖场对病原的快速检测。然而，由于引物之间的相互干扰、 多重LAMP检测条件的优化、W及检测结果分析等方面的难度和复杂性，至今尚未有报道能 同时检测所述四种水产养殖致病菌的多重LAMP方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP 的检测方法，目的是实现对大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌进行特异、灵 敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案予W实现：1、提供4组LAMP引物序列， 大菱解弧菌长度分别为49bp，43bp，ISbp，20bp的核巧酸序列，分别命名为111成斗1?、111成-BIP、1UXR-F3、1UXR-B3;创伤弧菌长度分别为45bp，46bp，20bp，19bp的核巧酸序列，分别命 名为metal Ioprotease-FIP、metalIoprotease-BIP、metalIoprotease-F3、 metal lop;rotease-B3;长度分别为47bp，44bp，19bp，2化P的核巧酸序列，分别命名为ompA- FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3;鱼肠道弧菌长度分别为 46bp，46bp，18bp，19bp 的核巧酸 序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3。2、配置LAMP反应体系，通过LAMP 反应程序对单一样品模板进行扩增，四种引物按比例加入，确定最佳反应体系和反应条件； 3、反应产物的鉴定:2%琼脂糖凝胶电泳;酶切分析;产物加入SYBR Green I，观察反应管中 颜色变化。具体包括如下步骤：
[0006] 1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知的大菱解弧菌IuxR基因（GenBank : JN684209.1)，创伤弧菌的metalIoprotease基因（GenBank:呪0548.1)，副溶血弧菌的ompA 基因（GenBank:JTGT01000603.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因（GenBank:KT265743)作为祀序 列，通过Primer Explore V4在线设计软件设计四条特异性引物，对于大菱解弧菌，在FIP的 Flc和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的Blc和B2之间添加-TTTT-连接子;对于鱼肠道弧 菌，在FIP的Flc和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的Blc和B2之间添加-TTTT-连接子，对 于V. vulnificus,在BIP的Blc和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的Flc和F2之间添加-TTTT-连接子；V.par址aemolyticus，在BIP的Blc和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的Flc 和F2之间添加-TTTT-连接子，设计W下四组LAMP引物：
[0007] 表1:多重LAMP引物组
[000引 [0009]
[0010] 2、配制LAMP反应体系
[0011] LAMP反应体系各组分含量：总体系25iil，包括Bst DNA聚合酶IiU(SOOOU), 10 X BstDNABuffer2.5i^l，PCR级甜菜碱化l(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5山，DNA模板化l，FIP/ BIP各0.化1 (1.6iiM) ,F3/B3各0.化1 (0.化M)，加双蒸水使反应体系总体积达到。
[0012] 3、LAMP反应体系扩增:将上述反应体系进行扩增反应，反应溫度58到65°C，反应时 间为15到90min.
[OOU] 4、扩增产物检测：2%琼脂糖凝胶电泳;酶切分析;产物加入SYBR Green I，观察反 应管中颜色变化。
[0014] 本发明提供的同时检测四种致病菌的多重LAMP检测方法，有W下优势：
[0015] -、灵敏度高对创伤弧菌和副溶血弧菌的检测可低至8CFU/山，比普通PCR高100- 1000倍。
[0016] 二、特异性强所需的特异性引物分别根据大菱解弧菌IuxR基因、创伤弧菌的 metal Ioprotease基因、副溶血弧菌的ompA基因和鱼肠道弧菌的ToxR基因的六个不同区域 进行设计，特异性比常规PCR强。
[0017] S、检测时间短化左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。
[0018] 四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可W进行电泳，也可W直接加 入SYBR Green I染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。
[0019] 五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不设及复杂仪器设备，产物加入SYBR Green I染料，可W直接用肉眼观察判断。
[0020] 综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌 和鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可W在实际生产中用于现场 检测，有利于及时发现鱼类养殖中的大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌。
【附图说明】
[0021 ] 图1反应溫度优化:溫度梯度从左往右依次58°C到65 °C8个梯度1，3,5,7,9，11，13， 15分别为58°C，59°C，60°C，6TC，62°C，63°C，64°C，65°C的阴性对照；2,4,6,8，10，12，14，16 分别为58 °C，59 °C，60 °C，6rC，62 °C，63 °C，64°C，65 °C 加模板。
[0022] M: marker，A:大菱解弧菌，B:创伤弧菌，C:副溶血弧菌，D:鱼肠道弧菌。
[0023] 图 2 反应时间优化：1-6 分别代表 15min，30min，45min，60min，75min，90min;
[0024] M为marker，A:大菱解弧菌，B:创伤弧菌，C:副溶血弧菌，D:鱼肠道弧菌。
[0025] 图3 LAMP扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析：
[00%] A:大菱解弧菌，B:创伤弧菌，C:副溶血弧菌，D:鱼肠道弧菌；
[0027] 泳道1:EcoRV酶切，2:Pst I酶切，3:BamHI酶切，4:EcoRI酶切，5:缓冲液对照，M为 marker > O
[002引图4灵敏度比较:A-D分别为大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、鱼肠道弧菌的PCR 检测结果，E-H分别为大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、鱼肠道弧菌的LAMP检测结果；
[0029] 泳道M:Marker，泳道 1-8:1.6 X l〇6c即AU-1.6 X l〇-iCFU/iU依次 10倍比稀释的细 菌模板。
[0030] 图5 SYBR Green I显色反应:对用大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧 菌四种细菌人工感染的大菱解鱼的肝、肾、脾、血进行多重LAMP扩增，产物加入SYBR Green I，感染组显示绿色，对照组无变化。
[0031] A:感染大菱解弧菌;B:感染创伤弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染鱼肠道弧菌；
[0032] 离屯、管1，3,5,7分别为健康组的脾、肾、肝、血;2,4,6,8分别为感染组的脾、肾、肝、 血。
[0033] 图6多重LAMP检测方法的应用：平板计数法结合多重LAMP确定四种细菌在不同组 织中的检出率
[0034] A:感染大菱解弧菌;B:感染创伤弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染鱼肠道弧菌。
【具体实施方式】
[0035] W下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。
[0036] 实施例1大菱解弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌多重LAMP方法的建立
[0037] 1材料:dNTPs、BstDNA聚合酶(含10X缓冲液）、PCR级甜菜碱等。
[003引 2方法
[0039] 2.1引物设计与合成
[0040] 根据GeneBank中已知的大菱解弧菌IuxR基因（GenBank: JN684209.1)，创伤弧菌的 metalloprotease基因（GenBank:U50548.1)，副溶血弧菌的 ompA基因（GenBank : JTGT01000603.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因（GenBank:KT265743)作为祀序列，设计四条特 异性引物。对于大菱解弧菌，在FIP的Flc和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的Blc和B2之 间添加-TTTT-连接子;对于鱼肠道弧菌，在FIP的Flc和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的 Blc和B2之间添加-Tm-连接子，对于V. vulnificus,在BIP的Blc和B2之间添加BamHI酶切 位点，在FIP的Flc和F2之间添加-TTTT-连接子;V. par址aemolyticus，在BIP的Blc和B2之间 添加PstI酶切位点，在FIP的Flc和F2之间添加-TTTT-连接子，设计并合成如表1所示四组 LAMP引物。
[0041 ] 2.2LAMP扩增条件的优化
[0042] 优化反应溫度和反应时间。检测所用的模板用煮沸裂解