微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法

文档序号:9919855
微量DNA 中甲基化CpG 岛高通量测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,属于基因测序领域。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是DNA的一种重要修饰碱基,它主要指在胞喀晚的5号碳原子上进行的 甲基化共价修饰,基本存在于所有物种的DNA中。胞喀晚的甲基化修饰存在于DNA中特殊结 构CpG中并在双链中成对出现;在脊椎动物结构基因组中,大部分的CpG结构域主要集中在 基因启动子区域,有约60 %~90 %的CpG区域中的胞喀晚上发生甲基化作用。DNA的甲基化 会导致DNA构象、稳定性、DNA与蛋白质相互作用的方式W及染色质结构发生改变,进而影响 基因的表达调控,使其在细胞发育与分化、特征性表型基因的表达W及X染色体失活等方面 发挥着巨大的作用。因而对于基因组中DNA甲基化位点的精准测序是全面理解追踪基因特 征和功能的重要方面。
[0003] 传统的单位点甲基化检测或者测序方法(如限制性酶切,限制新酶切-PCR,甲基化 特异性PCR、焦憐酸测序、巧光定量法等方法)受限于技术方法只能一次性检测单个或者多 个位点,且方法比较繁杂;基于忍片的甲基化图谱可W绘制基因组甲基化图谱,但该方法需 求量较小,且成本较高,不适用于大规模使用。近些年来随着第二代测序方法的发展,人们 可W通过高通量测序的方法进一步系统详尽准确的认识基因组中甲基化的分布情况。目前 基于高通量测序的甲基化测序方法有=种类型:(1)免疫沉淀的方法;(2)亚硫酸氨盐测序 W及(3)甲基化CpG随机扩增与测序的方法(MCTA-Seq)。免疫沉淀的方法需要购买具有特异 性识别效果的抗体,并且该种测序方法只能算得上是半定量,分辨率只能到lOObp。亚硫酸 氨盐测序方法的测序方法则能精确到碱基,是甲基化分析的金标准。该种方法是将DNA样品 用亚硫酸盐进行处理后将未发生甲基化的胞喀晚转化为尿喀晚,然后根据酶切,跑胶纯化 等步骤富集启动子W及CpG岛区域,进一步建立文库测序;但该方法程序复杂且耗时长耗费 高,性价比较低,不具有广泛的适用性。甲基化CpG随机扩增与测序的方法是基于亚硫酸盐 法的改进方法。该方法首先将收集到的DNA样品进行亚硫酸氨盐处理获得转化后的样品,然 后通过特定引物将特定为发生甲基化CpG富集区域(特别是CpG岛区域)进行扩增并建立DNA 文库,进而通过切胶的方法将目标区域片段进行富集,进而实现特定区域的甲基化CpG岛测 序分析。该方法降级成本且可W有效覆盖80% W上的CpG岛区域,对于DNA中甲基化的分布 分析具有重要的意义,但是该方法仍有S个较大的缺陷:1)获得的DNA文库始终包含有极大 量的引物二聚物与杂质,外加亚硫酸盐测序方法的局限性,极大的干扰到实际有效测序效 果,使之测序成本加大;2)引物能够捕获的CpG岛区域范围仍不能覆盖全部启动子区域;3) 该方法建库纯化步骤仍极为依赖操作者的判断和技艺,不利于自动化工业化操作。
[0004]目前尚缺少一个较为局效的商品化甲基化CpG岛局通量测序检测方法。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,
[0006] 本发明采用了如下技术方案:
[0007] 一种DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,其特征在于,包括W下步骤:
[000引1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理,获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样 品;
[0009] 2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中,并在PCR仪器中进 行线性扩增;
[0010] 3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶,于37°C中反 应30分钟,然后升高溫度使所述核酸外切酶失活;
[0011] 4)将步骤3)中的酶消化产物加入至恰有引物B的PCR体系中并进行线性扩增;
[0012] 5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系 中进行PCR扩增;
[0013] 6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的 DNA文库,并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序。
[0014] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:其 中,所述引物A的5'端序列可W与测序通用接头引物C(不限于illumina,ion proton, roche454,solid,BGIseq)相互退火结合;引物A在3'端有5-15个特殊的并可W与多个CpG区 域(至少两个CpG)退火结合的序列。
[0015] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:其 中,引物B中5 '端序列可W与接头引物D退火结合。
[0016] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物B的3'端序列会包含一段相对随机的长为5-15的碱基的退火结合序列,此序列含有0-15 个碱基C,0-15个碱基D与0-7个CpG。
[0017] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物B的3'端最后一个碱基为D(A、T、G混合物),第二、=个碱基紧接着一个CpG富集区,而在4 ~9个碱基则会包含一个碱基C,其他的碱基为D(A、T、G)。
[0018] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物5 '端序列和3 '端序列则是由4-20个碱基D (A、T、G混合物)连接。
[0019] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物B可W是单条引物,或者是多条引物的混合;
[0020] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:其 中,引物B是下述四条引物的混合物
[00別]5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤孤DGCGD-3 ' ;其中,D为A或T 或G。
[0022] 5' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤孤GDCGD-3 ' ;其中,D为A或T 或G。
[0023] 5' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤DG孤CGD-3 ' ;其中,D为A或T 或G。
[0024] 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤G孤DCGD-3 ' ;其中,D为A或T 或G。
[0025] 进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物C的序列如下:
[00%] 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '。
[0027]进一步,本发明的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法,还可W具有运样的特征:引 物D的序列如下:
[00巧]5,-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3,。
[0029] 上述步骤1)中,微量DNA的样品来源不局限于人、动物、植物、微生物等生命中的组 织、血液、细胞、体液W及分泌液等中提取的微量DNA样品;DNA提取方法不限于现有酪氯仿、 柱回收W及磁珠纯化等方式;
[0030] 上述步骤1)中,亚硫酸盐处理的试剂盒不限于自配或者是现有商品化的亚硫酸盐 处理试剂盒如:Zymo EZ Methylation-Direct Kit、EpiTect Bisulfite Kits、Methylamp Whole Cell Bisulfite Modification Kit、EpiGnome?Methyl-Seq Kit等;
[0031] 上述步骤2)中,DNA聚合酶优先使用热启动DNA聚合酶但也不局限于热启动DNA聚 合酶,如:HS EX Taq DNA聚合酶、PfU聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、 Phus ion聚合酶、OneTaq?热启动DNA聚合酶、OneTaq? DNA聚合酶、Vent民⑧DNA聚合酶、 VentR(ex〇-)DNA聚合酶、Deep VentR?DNA聚合酶、De邱 VentR(ex〇-)DNA聚合酶等;
[0032] 上述步骤2)中,引物A的5'端序列可W与测序通用接头引物C(不限于illumina, ion proton,;roche454,sol id,BGIseq)相互退火结合;引物A在3 '端有5-15个特殊的并可W 与多个CpG区域(至少两个CpG)退火结合的序列;连接该引物的5'端和3'端部分的则是长度 3~7个巧减基(A、T、G混合物)。例如,引物A的序列可W是:
[0033] 日'-TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGHHHHCCGCGCG-3'。
[0034] 上述步骤3)中,单链剪切的核酸外切酶不限于菌株来源,如核酸外切酶I,核酸外 切酶II等;
[0035] 上述步骤5)中,引物B中5'端序列可W与接头引物D退火结合;3'端序列会包含一 段相对随机的长为5-15的碱基的退火结合序列,此序列含有0-15个碱基C,0-15个碱基D与 0-7个CpGd3'端最后一个碱基为D(A、T、G混合物),第二、=个碱基紧接着一个CpG富集区,而 在4~9个碱基则会包含一个碱基C,其他的碱基为D(A、T、G);引物5'端序列和3'端序列则是 由4-20个碱基D(A、T、G混合物)连接;该引物可W单个使用也可同长度多个引物混合使用;
[0036] 上述步骤5)中,DNA聚合酶优先使用具有链置换效果的DNA聚合酶但不局限。比如: Klenow(exo)、地i29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶,大片段、Bst 2. ODNA聚合酶等;
[0037] 上述步骤6)中,PCR体系中接头引物C和接头引物D可W分别于引物A和B的5'端序 列退火结合;DNA聚合酶优先使用热启动DNA聚合酶但也不局限于热启动DNA聚合酶,如:HS EX化q DNA聚合酶、P化聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动
再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1