0091] 5.6,将样品管开盖在室溫中静置5min，使管中的乙醇挥发彻底；
[0092] 5.7,从磁架上取下样品管，向其中加入40.0 ul的dd此0用移液器将管壁上的磁珠 吹打重新混匀并静置5min;
[0093] 5.8,将样品管置于磁架中并保持5min使磁珠彻底贴与样品管壁，然后吸取38.5ul 的液体置于新的PCR管中；
[0094] 步骤6,将步骤5中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体 系中进行PCR扩增，进行15~25个循环。
[00M] 6.1，从步骤按照下表配置PCR体系混合物； 「00961 L〇〇97」 林林：引物C的浓度为50uM，序列化h
:
[009引 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0099] *林林：引物D的浓度为50uM，序列见下：
[0100] 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3，
[0101] 6.2,将上述配制好的PCR体系置于PCR仪器上，按照下述溫度变化进行第S轮指数 扩增，反应15~25个循环:95 °C，3min(第一次）；95 °C，30s; 65 °C，30s; 72 °C，Imin(n个循环）； 4°C ,forever；
[0102] 步骤7，将步骤6)中的PCR产物进行(如磁珠纯化等)获得具有特异长度(DNA片段大 小为200-35化P)的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序；
[0103] 7.1，PCR反应结束前15分钟将Ampure XP磁珠取出置于室溫中并剧烈震荡混匀；
[0104] 7.2，PCR结束后将样品管取出，吸取其中45. Oul的样品于新的PCR反应管中，向该 管中加入31.5ul的Ampure XP磁珠，并用移液器吹打混匀，室溫静置IOmin;
[0105] 7.3,将反应管置于磁架中，静置5min使管中的磁珠彻底贴壁后，吸取74ul的澄清 液并转移至新的PCR反应管中；
[0106] 7.4，向新的反应管中加入13.2ul的Ampure XP磁珠，并用移液器吹打混匀，再次室 溫静置IOmin;
[0107] 7.5,将反应管置于磁架中，静置5min使管中的磁珠彻底贴壁。配置新鲜的80%的 乙醇溶液；
[0108] 7.6,打开样品管，用移液器吸出管中所有的液体并丢弃；
[0109] 7.7,用移液器向管中加入200ul 80%的乙醇溶液，并静置30s，吸出管中的乙醇溶 液;重复该操作，并最终用IOul移液器彻底吸出管中的液体；
[0110] 7.8,将样品管开盖在室溫中静置5min，使管中的乙醇挥发彻底；
[0111] 7.9,从磁架上取下样品管，向其中加入20.Oul的Low TE(0.ImM EDTAaomM Tris-肥I，抑=7.5用移液器将管壁上的磁珠吹打重新混匀并静置5min;
[0112] 7. 10,将样品管置于磁架中并保持5min使磁珠彻底贴与样品管壁，然后吸取 17. Oul的液体测定浓度，至此获得高通量测序文库；
[0113] 7.11，使用4旨11611巧1〇31131736^2100分析系统对获取文库进行0臟片段大小进行 鉴定；
[0114] 7.12,将分析过的文库在Illumin址iseq 2500或者Illumina Hiseq XlO系统平台 上利用双末端测序的方法进行高通量测序，获得高通量测序数据；
[0115] 步骤8,将步骤7中的测序数据进行分析获得所需甲基化CpG岛的数据信息并与之 应用于科研或医疗诊断等方向。具体步骤如下：
[0116] 8.1，将测序数据进行初步处理，去除其中的接头引物;然后将所获取的高通量测 序数据利用数据分析软件Biomark将数据与人类基因组数据(如Hgl9)进行比对；
[0117] 8.2,将甲基化CpG岛的分布情况进行深入的生物信息学分析。
[0118] 实施例2:尿液中DNA中甲基化CpG岛高通量测序文库的建立
[0119] 使用医用尿液收集器直接收集人早晨第一管尿液(体积100毫升至500毫升），使用 13500g高速离屯、（12分钟)彻底去除尿液中可能存在的细胞和沉淀杂质。紧接着使用商品化 的试剂盒从尿液中提取循环游离DNA并用适当的体积(20微升)洗脱(DNA总量为1~long)。 紧接着使用商品化的亚硫酸盐试剂盒对该DNA体系进行亚硫酸盐化处理，使DNA中没有进行 5位修饰的胞喀晚转化为尿喀晚而保留DNA序列中5位甲基修饰的胞喀晚，最终将转化后的 样品洗脱至10.25微升体系。
[0120] 该转化过的DNA样品先使用含有引物A的PCR体系(共15微升)进行第一轮PCR线性 扩增后使用核酸外切酶1(0.5微升，30分钟)将体系中的过量引物A消化掉;反应结束后在高 溫条件下(80°C，20分钟)使得核酸外切酶I失活进而避免该酶对后续反应的干扰。紧接着在 反应管中直接多步加入含有引物B的PCR反应体系(共计20微升），使之在PCR仪器中进行第 二轮线性扩增。获得的样品管中直接加入第S步含有接头引物C和接头引物D的PCR反应体 系(体积共50微升)在PCR仪器中进行指数扩增18至22个循环。最终PCR管样品吸取45微升体 系使用商品化磁珠进行尺寸选择的多步纯化进而获得尺寸为190bp~300bp的DNA文库。将 获得的DNA文库经过质检后送测高通量测序并最终进行数据分析。
[0121] 本实施方式中从DNA的亚硫酸盐处理W及后续文库构建测序的步骤同实施例一。
[012：
[0123]
【主权项】
1. 一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样品； 2) 将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中，并在PCR仪器中进行线 性扩增； 3) 向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，于37 °C中反应30 分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶失活； 4) 将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增； 5) 将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进 行PCR扩增； 6) 将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的DNA文 库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序。2. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物A的5'端序列可以与测序通用接头引物C相互退火结合。3. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物B中5'端序列可以与接头引物D退火结合。4. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物B的3'端序列包含一段随机的长为5-15的碱基的退火结合序列，此序列 含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7个CpG。5. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物B的3'端最后一个碱基为D(A、T、G混合物），第二、三个碱基紧接着一个 CpG富集区，而在4~9个碱基则会包含一个碱基C，其他的碱基为D，D为A或T或G。6. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物B的5'端序列和3'端序列则是由4-20个碱基D连接形成。7. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，所述引物B是单条引物，或者是多条引物的混合。8. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 其中，引物B是下述四条引物的混合物： 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCDDDDDDDDGCGD-3 ' ；其中，D为A或T或G。 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCDDDDDDD⑶CGD-3 ' ；其中，D为A或T或G。 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCDDDDDD⑶DCGD-3 ' ；其中，D为A或T或G。 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCDDDDD⑶DDCGD-3 ' ；其中，D为A或T或G。9. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 引物C的序列如下： 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '。10. 如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于： 引物D的序列如下： 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3 '。
【专利摘要】本发明提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，包括步骤：1)将DNA样品进行亚硫酸盐处理；2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中进行线性扩增；3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，反应后使核酸外切酶失活；4)将步骤3)中的产物加入到含有引物B的PCR体系中进行线性扩增；5)将步骤4)中的产物加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行扩增；6)将步骤5)中的PCR产物进行纯化获得具有特异长度的DNA文库，并进行测序。本发明采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列中甲基化CpG岛序列对待测目的片段进行高通量测序效率极高。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105695577
【申请号】CN201610119392
【发明人】陆星宇, 宋艳群
【申请人】上海易毕恩基因科技有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月2日