一种快速检测副鸡禽杆菌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及试剂盒检测技术领域，具体的说设及一种快速检测副鸡禽杆菌的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 副鸡禽杆菌是细小的革兰氏阴性菌，细菌长约1-3皿，宽0.4-0.8皿，无鞭毛，不形 成芽抱，毒力菌株往往有芙膜。副鸡禽杆菌培养条件较为苛刻，需要在培养基中加入MD，但 在南非也发现NAD非依赖性分离株，说明NAD不是必需的营养成分。该菌兼性厌氧，在固体培 养基上培养时需厌氧环境或3%-10%的C〇2。基于血凝抑制试验建立起来化ge方法将副鸡 禽杆菌分为A、B、CS种血清型。副鸡禽杆菌引起的疾病叫做鸡传染性鼻炎。病鸡精神委顿， 垂头缩颈，食欲明显降低。最初自鼻孔流出水样汁液，继而转为浆性黏性分泌物，鸡只有时 甩头，打喷暧，眼结膜发炎，眼险肿胀，有的流泪，一侧或两则颜面肿胀，部分病鸡可见下颂 部或肉養水肿。该病潜伏期短，传播迅速，短时间内便可波及全群。育成鸡表现为生长不良， 产蛋鸡产蛋量明显下降，处在产蛋高峰期的鸡群产蛋量大幅度下降10%-40%，有时高达 70 %至完全停产。混合感染时可引起病鸡死亡，给养殖业造成了重大的损失。
[0003] 目前进行细菌分类鉴定中常用的祀基因是16S rRNA，它是细菌染色体上编码rRNA 相对应的DNA序列，具有高度的保守性，16s rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的 一种强有力工具。副鸡禽杆菌的生化反应复杂，不同毒力的菌株会有不同的结果；间接血凝 试验虽是目前最准确有效的方法，但此方法用时较长;PCR检测方法虽然特异性强，但是需 要的PCR扩增仪十分昂贵。因此，发明一种操作简便、准确快速的检测副鸡禽杆菌的方法对 鸡传染性鼻炎预防和治疗具有重要意义。
[0004] 环介导等溫扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication,简称LAMP) (国际专利公开号WOOO/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，其特点是 针对祀基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等溫条件下(60~ 65°C )，化内特异地扩增出IO9-IOiD拷贝祀序列，扩增结果可直接对扩增副产物焦憐酸儀沉 淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的巧光染料优选SYBR Green I染色， 即可通过肉眼判定。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时 缩短了检测时间。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检 测已有很多报告。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度、操作简 便的检测副鸡禽杆菌的试剂盒及其检测方法。
[0006] 首先，本发明的第一个技术目的是提供一种高灵敏度、高特异性的用于检测副鸡 禽杆菌的LAMP引物组，包括:外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3的核巧 酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP和BIP的核巧酸序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0007]在此基础上，本发明进一步提供一种简单、快速、准确的检测副鸡禽杆菌的试剂 盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。
[000引所述试剂盒为LAMP试剂盒，除了包含上述引物组外，还包括:LAMP缓冲液、BstDNA 聚合酶、dNTPs、无菌去离子水、阳性对照和阴性对照。如果采用巧光目视法时，还包括巧光 染料。
[0009] 优选的，本发明的试剂盒中LAMP引物组的浓度为:外引物F3和B3的浓度为SpmolAi L内引物FIP和BIP的浓度为40pmolAiL。
[0010] 更为优选的，本发明的试剂盒包括：
[00川 1H0XLAMP缓冲液；2)8000U/mL BstDNA聚合酶；3)10mM dNTPs;4)LAMP引物组；5) 无菌去离子水;6)巧光染料：10 X SYBR GreenI; 7)阳性对照：0083、022和Modesto副鸡禽杆 菌基因组DNA;阴性对照:无菌去离子水。
[0012] 其中所述的10XLAMP缓冲液含有25°C下抑8.8的200mM Tris-HCiaoomM氯化钟、 IOOmM硫酸锭、20mM硫酸儀、8M甜菜碱和体积百分浓度为1 %的曲拉通X-100。
[0013] 更进一步的，本发明提供一种采用上述的试剂盒快速检测副鸡禽杆菌的方法。其 中反应体系优选为：每25化反应液中，引物组的引物用量为各IiiUBstDNA聚合酶1化， lOmmol/L的dNTPs3.扣L，待检样品DNA2~化L，无菌去离子水适量;反应条件为:65°C恒溫反 应60min，并在80°C持续lOmin。其中待检样品基因组DNA按常规方法提取或试剂盒提取。
[0014] 当试剂盒采用巧光目视法时，反应体系中还包括10XSYBR Green I 2.化L，反应 体系总量保持25.0化不变。
[0015] 本发明试剂盒反应完成后肉眼观察液体变混浊(如果加入巧光染料则颜色由澄色 变为绿色），则说明样品中含有副鸡禽杆菌;或使用2%浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可 呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。
[0016] 本发明的试剂盒W及检测方法具有W下优点：
[0017] 1)快速高效:整个扩增过程仅需35~50min，扩增产量可达IO9-IQi日个拷贝祀序列；
[0018] 2)操作便捷:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变 性等繁琐步骤，只需要普通水浴锅即可进行检巧
[0019] 3)特异性强:本发明根据副鸡禽杆菌16s DNA序列设计4条特异性引物，应用上述 引物，扩增祀序列的4个区域，4个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其 特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，确保反应的顺利进行；
[0020] 4)灵敏度高:最低检测极限可达到0.5~0.化g/管，比普通PCR高1-2个数量级；
[0021] 5)适合现场检测：肉眼观察液体变浑浊即为阳性，澄清透明则为阴性;若采用巧光 目视法观察颜色变化，颜色变为绿色为阳性，澄色为阴性;或使用2%浓度琼脂糖凝胶电泳 检测，阳性可呈现典型的特异梯状条带，阴性无此现象。
[0022] 本发明的LAMP检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高、适合现场 检测等优点，不需要配置相关检测仪器，为副鸡禽杆菌的检测提供了新的技术支撑，可用于 畜牧业生产单位、兽医检测实验室、屠宰场、出入境和各疾病预防控制中屯、筛查和检测，具 有广阔的市场前景，适于推广应用。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明LAMP检测方法的外引物与内引物比例优化试验结果图；M为DL-SOOOmarker，泳道号1-6分别为外、内引物比1: 5，1:6，1: 7，1: 8，1:9，1:10，泳道7为阴性对 照；
[0024] 图2为本发明LAMP检测方法的引物缺省试验结果图；M为化-SOOOmarker; 1-7分别 为内外引物全有;无上游外引物F3;无下游外引物B3;无上游内引物BIP;无下游内引物FIP; 无上、下游外引物F3、B3;无上、下游内引物FIB、BIP;泳道8为阴性对照；
[002引图3为本发明LAMP检测体系中不同浓度Mg2+试验结果图;1为0心5000111曰'1?5^ 1-6分 别为浓度SmM、6mM、7mM、SmM、9mM、1 OmM 的 MgS04; 7为阴性对照；
[0026] 图4为本发明LAMP检测体系中不同浓度Bst DNA聚合酶试验结果图；M为DL-SOOOmarker; 1-6分别对应BstDNA polymerase添加量依次为0.4化、0 .化L、0.如L、1.0化、 1.化L、l.化L;7为阴性对照；
[0027] 图5为本发明LAMP检测体系中不同浓度dNTPs试验结果图;]\C%Dk5000marker; 1-7 分别对应反应体系中的dNTPs的浓度依次为0.8mnK)L/L、1 .OmiroL/L、1.2mnK)L/L、1.4mnK)L/L、 1.6mmoL/L、1.8mmoL/L、2. OmmoL/L; 8为阴性对照；
[002引图6为本发明LAMP检测条件的不同反应溫度试验结果图；M为化-5000marker; 1-7 分别对应溫度梯度为61.0 °C、62.0 °C、63.0 °C、64.0 °C、65.0 °C、