鉴定鲁棉研34号品种纯度的ssr分子标记引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组及其应用，利用 鲁棉研34号的特征引物组对鲁棉研34号供检样品进行品种纯度鉴定，属于生物技术技术领 域。
【背景技术】
[0002] 棉花是我国重要的经济作物，在我国国民经济与社会发展中具有重要地位。棉花 杂交品种在生活力、生长势、抗逆性和丰产性方面较棉花常规品种有比较明星的优势，因此 受到广大棉农的青睐，其推广种植面积基本覆盖长江流域棉区，对提高棉花产量，稳定棉花 生产，提高棉农收益起到重要作用。杂交棉品种纯度是保证杂种优势得W发挥的基础，也是 衡量杂交棉种子质量的主要指标。由于在棉花杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄， 常会出现假杂交种，导致杂交品种杂种优势下降，给生产造成巨大经济损失，同时，在销售 环节中一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润W劣充好，人为渗假等，导致优良品 种纯度受到严重影响，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，为有效监 控优良品种的生产质量，规范优良品种的销售市场，建立一套快速、准确（简便、经济)鉴定 鲁棉研34号杂交棉品种纯度的方法是棉花生产经营过程中最为迫切解决的问题之一。
[0003] 目前我国棉种的品种纯度鉴定主要依靠田间小区种植形态鉴定方法，鉴定所需时 间长，成本高，并受季节的限制，近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，WDNA为基础的 分子标记技术可有效鉴定品种在分子水平上的遗传差异，与其它分子标记相比，SSR (Simple Sequence Repeat,简单序列重复)分子标记技术在鉴定杂合位点方面具有独特的 优越性:SSR分子标记呈共显性，标记数量丰富，多态性高，遗传稳定，不受环境条件影响。目 前SS財示记已广泛应用于遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究和品种资源鉴定等方面，并 发挥着越来越重要的作用;很多专家学者对棉花品种纯度鉴定的分子标记技术进行了一定 的研究，研究结果表明，利用分子标记进行棉花品种纯度鉴定是可行的。
[0004] 鲁棉研34号是W自育抗虫棉新品系鲁S157为母本，W从GK12系选的P12为父本配 制成的Fl代杂交种，2005年获农业部转基因生物安全证书，2008年经第二届国家农作物品 种审定委员会第二次会议审定通过。该品种长势强，整齐度好，纺纱均匀指数154,结铃性 强，成铃吐絮集中，耐枯萎病，耐黄萎病，是综合性状比较理想的优良品种。为保证该品种的 生产质量，提高品种纯度检测效率，非常有必要针对鲁棉研34号品种研发一种经济简便实 用的纯度鉴定方法。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记 引物组及其应用。利用该引物组可W实现快速检测鲁棉研34号品种纯度的问题。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标记引物组，该引物组由5对引物组成， 分别为：
[000引分子标记NAU3995的引物，上游引物核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核 巧酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009] 分子标记MUCS101的引物，上游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核 巧酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0010] 分子标记DPL0917的引物，上游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核 巧酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[00川分子标记D化0528的引物，上游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核 巧酸序列如SEQ ID NO.8所示；
[00切分子标记熱114926的引物，上游引物核巧酸序列如569 10^).9所示，下游引物核 巧酸序列如沈Q ID NO. 10所示。
[0013] 上述SSR分子标记引物组在鉴定鲁棉研34号品种纯度中的应用。
[0014] 上述应用，步骤如下：
[0015] (1)将待检测棉花干种子室溫条件下浸泡后，去除种皮，浸入裂解缓冲液中，破碎 后，在60~70°C水浴15~25min，离屯、，取上清，然后加入预冷的异丙醇，离屯、，取沉淀，经洗 涂、惊干，加双蒸水溶解后，离屯、，取上清，制得DNA提取样品；
[0016] (2似步骤（1)制得的DNA提取样品为模板，分别WSSR分子标记引物组中的5对引 物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0017] (3)分别对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行电泳检测，经染色后，将染色结果的带 型与鲁棉研34号父、母本的染色结果的带型进行对比，同时具有父母双亲本特异条带的种 子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，种子纯度按如 下方法计算：
[0018] 种子纯度=检测到的与鲁棉研34号纯品的带型相同的个数/检测总数X 100%。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的浸泡时间为18~24小时；离屯、条件为:4°C、 120(K)r/min离屯、8min;所述洗涂为采用体积百分比为70%的乙醇溶液洗涂;所述预冷的异 丙醇加入量为0.7倍体积。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的裂解缓冲液中含有如下成分：
[0021] 2wt%CTAB(十六烷基S甲基漠化锭），0.02mol/L EDTA(四乙酸二氨基乙烧）， 1.4mol/L 船(：1，〇.1111〇1/1；打13-肥1，2*1%?￥?(聚乙締化咯烧酬），1*1%0-琉基乙醇。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下（1化L):
[0023] IOXPCR Buffer 化L，10mM dNTP Mix 0.化L，10mio1/L 的正向引物 0.化L、10y mol/L的反向引物0.6化，5U Taq DNA聚合酶0.1化，20~200ngAiL的待测样品DNA 2化， 加也0 5.姐1^。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应程序如下：
[0025] 94 °C 预变性 5min; 94°C 变性 40s，55 °C 退火 45s，72 °C 延伸 50s，循环 32 次；72 °C 延伸 5min。
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述电泳为采用8wt%非变性聚丙締酷胺电 泳。
[0027] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，染色步骤如下：
[002引用o.lwt%的AgN03溶液染色lOmin，再用含2wt%化OH和0.4wt%甲醒的水溶液显 影至带型清晰。
[00巧]有益效果
[0030] 1、本发明通过对杂交种鲁棉研34号及其亲本基因组DNA特征SSR引物进行筛选研 究，鉴定得到能够在杂种一代中同时产生具有父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复 性好、可靠性强的鲁棉研34号特征SSR引物5对，构成鉴定鲁棉研34号品种纯度的SSR分子标 记引物组，该引物组可用于快速检测鲁棉研34号品种的种子纯度；
[0031] 2、本发明通过采用了适用于上述引物组的检测方法，通过对DNA提取方法等步骤 进行改进，获得了效果好、检测速度快、检测结果准确、经济简便、稳定可靠、不受环境条件 及发育时期影响的优点，适用于快速检测鲁棉研34号品种的种子纯度；
[0032] 3、本发明直接采用种子提取DNA，省略了苯酪:氯仿:异戊醇去除蛋白质步骤，不使 用有毒试剂，有利于大规模快速提取DNA;
[0033] 4、本发明简化了染色步骤，大大提高了电泳检测效率。
【附图说明】
[0034] 图1为鲁棉研34号父本、母本及Fi品种特异SSR分子标记引物组的标准电泳图谱；
[0035] 其中：M为分子量标准，Pl为鲁棉研34号父本，P2为鲁棉研34号母本，Fl为鲁棉研34 号Fl杂交种；
[0036] 图2所示为特征引物对NAU3995对鲁棉研34号商品样品种子的纯度检测结果；
[0037] 其中：M为分子量标准，1:"鲁棉研34号'母本;2:"鲁棉研34号'父本;3:"鲁棉研34 号标准品徘'F1杂交种;4-23号为鲁棉研34号商品种子；
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不用来限制本发明的保护 范围。
[0039] 生物来源
[0040] 实施例中所述的鲁棉研34号商品种子购自山东鲁壹棉业科技有限公司。
[0041 ] 实施例1
[0042] 提取DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行非变性聚丙締酷胺凝胶 电泳，统计结果并筛选特征性引物。
[0043] 1.棉花基因组DNA提取
[0044] 本实施例的实验材料为鲁棉研34号品种和鲁棉研34号父母本(购自山东鲁壹棉业 科技有限公司）。
[0045] 将棉花干种子室溫条件下浸泡20小时左右，剥掉种皮，将萌动的种仁放入2ml离屯、 管中，加入700iU裂解缓冲液（组成成分：%CTAB，0.02mol/L抓TA，1.4mol/L化Cl， 0 . Imo 1 /LTri S-HCl，% PVP，Iwt %(6-琉基乙醇），用组织研磨仪将种子打碎。65 °C水浴 20min，间隔IOmin左右轻摇一次。