检测tert基因启动子c250t、c228t突变位点的方法、引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别设及检测TERT基因启动子C250TX228T 突变位点的引物、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤(glioma)是神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤。已进行的临床和基 础研究都证明脑胶质瘤预后极差，无法控制的肿瘤细胞增殖、减慢的肿瘤细胞调亡速度、月中 瘤细胞的侵袭性W及新生血管生长等恶性肿瘤生物学特征使得脑胶质瘤的治疗面临巨大 的困难。人端粒酶是肿瘤标志物之一，在肿瘤发生、发展过程中，端粒酶的活化起着重要的 作用。端粒酶由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白、端粒酶逆转录酶(TERT)组成。TERT被认为是端 粒酶活性的关键决定因子，它可W延长由于细胞分裂不断缩短的端粒，从而使细胞获得永 生，只在端粒酶阳性肿瘤组织和永生化细胞中表达。
[0003] 近年来，通过全基因组测序，发现TERT基因启动子突变在脑胶质瘤患者中非常常 见，且TERT的表达量水平升高。文献报道TERT基因启动子存在C228T和C250T两个突变热点， 在2级与3级脑胶质瘤患者中的发生率分别为10%，在4级脑胶质瘤患者中的发生率分别为 74%。
[0004] 本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法检测TERT基因启动子C250T、 C228T的突变，并且所设计的扩增引物的扩增产物可W涵盖启动子中包括C250T和C228T在 内的所有突变位点。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发 生在互补性最强的序列之间，当退火溫度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增 产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产 物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终 优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突 变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供检测TERT基因启动子C228TX250T突变位点的引物，所述 引物包括扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，其碱基序列为：
[0006] TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0007] TERT-R:CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
[000引进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
[0009] TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0010] TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC〇
[0011] 进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为:T邸T-F: T邸T-R = 1:1。
[001 ^ 进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：TERT-S-F: TERT-S-R = 1:1。
[0013] 进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95°C预变性 IOmin;第二阶段，变性溫度94°C30sec，退火溫度64°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循环16 次，每循环一次，所述退火溫度降低〇.5°C;第S阶段，变性溫度94°C30sec，退火溫度58°C 30sec，延伸溫度72°C30sec，循环24次;第四阶段，72°C10min;第五阶段，扩增反应结束，扩 增产物在4°C下保存。
[0014] 本发明的目的在于还提供一种检测TERT基因启动子C228TX250T突变位点的方 法，其包括如下步骤：
[001引 （1)提取样本DNA;
[0016] (2)利用一对扩增引物TERT-F和TERT-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
[0017] (3)利用一对测序引物TERT-S-巧日TERT-S-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所 述扩增产物的碱基序列；
[0018] (4)将(3)中的碱基序列与TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref进行比较，确 定突变位点是否存在，所述扩增引物和测序引物序列分别为：
[0019] TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0020] TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC
[0021] TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0022] TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC〇
[0023] 进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为:第一阶段，95°C预变性IOmin;第二阶段，变 性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72 °C 30sec，循环16次，每循环一次，所述 退火溫度降低〇.5°C;第S阶段，变性溫度94°C30sec，退火溫度58°C30sec，延伸溫度72°C 30sec，循环24次;第四阶段，72°C10min;第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4°C下保存。
[0024] 本发明的目的在于还提供一种检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的试剂 盒，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂;无水乙醇;检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳 性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物TERT-S-F 和TERT-S-R，测序体系反应液包括一对测序引物TERT-F和TERT-R，其碱基序列分别为：
[00 巧]TERT-F:AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0026] TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC [OO^ ] TERT-S-F:AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0028] TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC〇
[00巧]进一步地，所述试剂盒包括TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref。
[0030] 进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括邮碱性 憐酸酶和核酸外切酶I。
[0031] 本发明的有益效果:本发明设计出扩增产物涵盖TERT基因启动子C228TX250T突 变位点的正、反向引物，构建出稳定的Touch-down PCR扩增体系，所述扩增产物不仅可W包 含突变位点C228TX250T，而且还可W包括所有其他的潜在突变位点，同时在扩增时，富集 正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向 扩增引物的浓度、退火溫度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对 PCR扩增产物进行扩增、纯化后变性和直接测序，从而检测TERT基因启动子包括C228T、 C250T在内的各种突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。
【附图说明】
[0032] 图1 TERT基因启动子PCR扩增电泳结果图，其中M为TAKARA DL2000。
[0033] 图2样本1 TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
[0034] 图3样本2 TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
[0035] 图4样本3 TERT基因启动子C228T突变位点检测结果图。
[0036] 图5样本1 TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
[0037] 图6样本2 TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
[003引图7样本3 TERT基因启动子C250T突变位点检测结果图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0040] 实施例1
[0041 ] 检测TERT基因启动子C228TX250T突变位点的引物，包括：扩增TERT基因启动子 C228T、C250T突变位点的正、反向引物;其碱基序列为：
[004。 T邸T-F:AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0043] TERT-R:CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。
[0044] 优选地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为
[0045] TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG
[0046] TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC〇
[0047] 在检测中，先利用上述正、反向引物对TERT基因启动子C228T、C250T突变位点进行 扩增，获得扩增产物，然后利用上述一对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的碱 基序列。
[004引检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的试剂盒，包括:样本DNA抽提试剂(例 如使用天根生物的试剂盒来抽提样本DNA);无水乙醇;检测体系PCR反应液、测序体系反应 液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
[0049]检测体系PCR反应液包括：2 XPCR Buffer ;2mM dNTPs;KOD FX DNA Polymerase (IUAU);扩增TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的正、反向引物TERT-FdO皿KTERT-R (IOym) O
[(K)加]测序体系反应液包括:EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDK高度去离子甲 酷胺）、测序引物：TERT-S-F(3.2皿）、TERT-S-R(3.2皿），W及Bigdy e Terminator V3.U购 买自美国Applied Biosystems公司）。
[0051 ] TERT-F、T邸T-R;T邸T-S-F和TERT-S-R的碱基序列如下所示： 「0化 21
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[0054] 检测体系PCR反应液试剂配制如下：
[0化5]
[0056] 阳性对照品：含有TERT序列的溶液。
[0057] 阴性对照品:无TERT序列的溶液。
[0化引空白对照品：2iil生理盐水或不加任何物质。
[0化9] 优选地，该试剂盒还包括TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref，其碱基序列 如下所示：
[0060] GCTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGAGAGGGCGGGGCCGCGGAAAGGAAGGGGAGGGGCTGGGAGGGCCCGGAGGGG GCTGGGCCGGGGACCCGGGAGGGGTCGGGACGGGG