粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物来源检测方法，具体地说是一种粗品肝素钢不同种属来源的快速 鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 肝素钢是黏多糖硫酸醋类物质，因其具有抗凝血作用，广泛应用于血栓形成或栓 塞性疾病的临床治疗。近年来研究证明，肝素钢还具有降血脂作用。目前，肝素钢主要来源 于猪、牛或羊的肠黏膜。但是，牛源性和羊源性的肝素钢存在被相关病毒感染的风险，且导 致血小板减少症及血栓综合征等不良反应的发生概率要远远大于猪源性肝素钢。因此，在 临床使用中人们会应尽量选择猪源性肝素钢。然而，实际生产中由于生产材料来源复杂等 多方面原因，往往会导致猪来源的生产原料存在被牛、羊等来源的动物材料污染的可能性。 因此，建立猪源、羊源、牛源等动物来源成分的鉴别方法对控制药品质量、防止异种动物源 性成分的污染至关重要。
[0003] 目前，现有技术中检测不同种属来源的肝素钢的方法主要有免疫化学和核酸检测 等。其中巧光定量PCR方法核酸检测使用相对更为广泛，具体是先从粗品肝素钢中提取动物 残留核酸，再采用巧光定量PCR进行检测。巧光定量PCR技术是利用巧光信号的变化实时检 ^UPCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板 进行定量分析。运种检测方法结果较为精准，但是运种方法检测肝素钢时存在一定缺陷，因 为肝素对PCR有很强的抑制活性，所W在做定量PCR前需要使用肝素酶对肝素钢样品进行前 处理，其操作复杂繁琐、肝素酶和定量试剂费用高昂，运使得该方法在技术力量薄弱的中小 企业使用受到了很大的局限。可见，研发成本低、操作便捷、准确度高的不同种属来源的肝 素钢的鉴别方法是行业内积极探索的课题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种粗品肝素钢不同种属来源的快速鉴别方法，W解决现有检测 方法要么无法控制肝素对后期PCR的抑制导致检测准确性降低，要么前处理操作繁琐复杂、 成本较高的问题。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的:粗品肝素钢不同种属来源的快速鉴别 方法，包括W下步骤： (a) 将待测粗品肝素钢溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钢中 的总DNA，得待测粗品肝素钢总DNA;所述溶剂A为每100血水中溶解有2g氯化钢和IOg乙醇的 混合溶液;所述粗品肝素钢、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg: ImL: (b) 设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为： 猪源性成分鉴别引物： 上游引物:ATCTACATGATTCATTACAATTAC， 下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA; 羊源性成分鉴别引物： 上游引物:ACACAACTTCTACCACAACCC， 下游引物:AAACAATGAGGGTAACGAGGG; 牛源性成分鉴别引物： 上游引物:GCCATATACTCTCCTTGGTGACA， 下游引物:GTAGGCTTGGGAATAGTACGA; (C)W步骤(a)所得待测粗品肝素钢总DNA作为DNA模板，采用步骤(b)设计的猪、羊、牛 源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增，其扩增体系为:DNA模板化L、上游引物化L、下游引物 化L、2倍PCR试剂预混液2化L，用d地2〇补齐至50化； PCR反应程序为:在95 °C下预变性5min;在95 °C下变性15s;在63 °C下退火30s;在72 °C下 延伸30s;热循环次数为40次;得扩增产物； (d)将所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如得到了分子量大小为15化P的特异性 条带，则表明该待测粗品肝素钢中含有猪源性肝素钢成分;如获得了分子量大小为14化P的 特异性条带，则表明该待测粗品肝素钢中含有羊源性肝素钢成分;如获得了分子量大小为 271bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钢中含有牛源性肝素钢成分。
[0006] 本发明步骤(a)中所述生物磁珠是指磁珠MGlOl，为天根生化科技(北京)有限公司 的市售产品。所述生物磁珠是指能够吸附DNA的磁珠，由特殊工艺对磁性纳米颗粒的表面进 行修饰，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸， 能够达到快速分离纯化核酸的目的。
[0007] 本发明步骤(a)所述的通过磁珠法提取粗品肝素钢中的总DNA的具体步骤是:①将 加入生物磁珠的待测粗品肝素钢溶液置于离屯、管中振荡10s，置于室溫解育lOmin，期间每 隔3min振荡混匀IOs;②将离屯、管放置于磁力架上静置Imin,待磁珠完全吸附时除去液体； ③将离屯、管从磁力架上取下，加入6倍所述生物磁珠体积的漂洗液A，振荡混匀Imin;④将离 屯、管放置于磁力架上静置1 min,待磁珠完全吸附后，除去液体;⑤将离屯、管从磁力架上取 下，再加入6倍所述生物磁珠体积的漂洗液B，振荡混匀1 min;⑥将离屯、管放置于磁力架上 静置1 min,磁珠完全吸附后，除去液体;⑦重复步骤⑤-⑥一次;⑧再将离屯、管置于于磁力 架上，56°C惊干5-10 min;⑨将离屯、管从磁力架上取下，加入20化的dd出0,56°C振荡混匀5 min;⑩将离屯、管放置于磁力架上静置2 min，待磁珠完全吸附后，将得到的DNA转移至一个 新离屯、管中即可;所述漂洗液A为每IL水中溶有O.Smol的LiCl、0.5mol的NaCl和200g的PEG, 其pH值为7.0;所述漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇。
[000引本发明步骤(d)中所述的2倍PCR试剂预混液是指:Tris-HCKpH值为8.3)20mmol/ UdNTP 0.4mmol/L、KCl 100mmol/L、MgCl2 3mmol/L、taq酶0.05U/mL，溶剂为(1地20。
[0009]本发明步骤(d)中所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳的具体工艺为:取20化 所述扩增产物加入上样缓冲液化L，采用质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，电压 100V，电泳20min。上样缓冲液是指IL水中溶解有O.Olmol的抓TA、0.25g的漠酪兰、0.25g的 二甲苯氯和50g的甘油的混合溶液。
[0010]本发明通过从粗品肝素钢中提取总DNA、设计特异性引物、PCR扩增反应W及电泳 数据分析等一系列步骤准确地检测了粗品肝素钢的不同种属来源，同时也快速鉴别了该粗 品肝素钢是否为混杂有羊源性或牛源性成分的产品，运为医药采购把关及临床医用提供了 可靠的检验结果。本发明的特别创新之处在于对待测样品总DNA采用的是特定磁珠提取法， 该方法有效解决了传统方法中存在的肝素对PCR抑制的问题，而且大大降低了成本，方法简 洁明了，快速简便，重复性好，易操作，准确性高，适于在鉴定肝素粗品质量中推广应用。
【附图说明】
[0011] 图1为鉴别猪、羊、牛源性粗品肝素钢的电泳图谱。图中1为分子量标准；2.为牛源 性成分阴性对照;3为1000 pg/化牛源性成分扩增产物特异性条带;4为10000 pg/化猪源性 成分扩增产物特异性条带;5为1000 pg/化猪源性成分扩增产物特异性条带；，6为100 PgAi L猪源性成分扩增产物特异性条带;7为猪源性成分阴性对照;8为羊源性成分阴性对照;9为 10000 pg/化羊源性成分扩增产物特异性条带；10为lOOOpg/化羊源性成分扩增产物特异性 条带；11为100 PgAiL羊源性成分扩增产物特异性条带。
[0012] 图2为鉴别猪源性粗品肝素钢中混杂羊源性成分的电泳图谱。图中1为分子量标 准，2为产品含有质量百分比为10%的羊源性肝素钢的电泳条带;3为产品含有质量百分比为 1%的羊源性肝素钢的电泳条带;4为产品含有质量百分比为0.1%的羊源性肝素钢的电泳条 带;5为阴性对照。
[001引图3为本发明与对比例提取粗品肝素钢中总DNA数量电泳图谱。图中巧分子量标 准，2为样本A电泳条带，3为样本B电泳条带。
【具体实施方式】
[0014] 下面实施例用于进一步详细说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。但 不W任何形式限制本发明。
[0015] 本发明中所述使用的生物磁珠来自天根生化科技（北京）有限公司市售的磁珠 MGlOlo
[0016] 实施例1猪源性粗品肝素钢样品的检测 (1)提取猪源性粗品肝素钢的总DNA:饭称取猪源性粗品肝素钢30mg溶于ImL的溶剂A中 (1 OOmL水中溶解有2g化Cl和1 Og乙醇的混合溶液），置于离屯、管中；?向样本溶液中加入30 化生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10 S;③室溫解育10 min,期间每3 min上下颠倒混匀10 S，使磁珠和核酸充分结合，离屯、收集附着在管壁及管盖的液体;戚将离屯、管放置于磁力架 上静置1 min，待磁珠完全吸附时，小屯、吸去液体;霞将离屯、管从磁力架上取下，加入500 iiL 漂洗液A(漂洗液A为IL水中溶解有0. Smol的LiCl、0.5mol的化Cl W及200g的PEG的混合溶 液，pH 7.0)，振荡混匀1 min;風将离屯、管放置于磁力架上静置1 min,磁珠完全吸附后，小 屯、吸去液体;逆将离屯、管从磁力架上取下，加入500化漂洗液B(漂洗液B为质量百分比浓度 为80%的乙醇），振荡混匀1 min;厳将离屯、管放置于磁力架上静置1 min,磁珠完全吸附后， 小屯、吸去液体;?:重复步骤?-敏一次;⑩离屯、管于磁力架上，56°C惊干10 min;?将离屯、管