抑制lncRNA用于治疗黑素瘤的制作方法
【专利说明】抑制IncRNA用于治疗黑素瘤 发明领域
[0001] 本申请设及癌症领域，具体地设及黑素瘤领域。已经发现，与黑素细胞相比，在黑 素瘤(而非其它肿瘤）中，一种特定的长链非编码RNA(IncRNA)特异地上调。在黑素瘤细胞中 抑制该IncRNA可W导致调亡的诱导，是黑素瘤医治中的一种新的治疗策略。
[0002] 发明背景
[0003] 皮肤恶性黑素瘤是导致皮肤癌相关死亡的主要原因。其发生率在全世界范围增加 得比任何其它癌症都要快，该病对于患有远距离肿瘤转移疾病的患者来说，5年存活率不到 20%。改善运种具有侵略性、抵抗化疗和放疗的疾病的临床治疗结果一直是一个重大的临 床挑战。然而，人们在了解黑素瘤的病因学和遗传基础上取得了显著的进展。运些进展最近 导致在对该疾病祀向治疗的测试中获得了满意的效果。Ras/Raf/MEK/E服通路已经被鉴定 为黑素瘤中细胞增殖的主要调控因子，在多达90%的人黑素瘤中，ERK被过度激活。活性 NRAS突变是激活该通路的常见途径;影响第61位密码子的突变(NRASQ61K)最为普遍。作为3 个人类RAF基因之一的BRAF也常在黑素瘤中发生突变，最普遍的突变是在第600位上谷氨酸 对鄉氨酸的替换(V600E)dBRAFV600E刺激组成型E服信号传导，导致黑素细胞过度增殖。使 用新的1类RAF选择性抑制剂化X4032的早期临床经验显示了在患BRAFV600E阳性黑素瘤的 患者中前所未有的80%的抗肿瘤反应率;不幸的是，患者在最初反应的几个月内获得抗药 性，目前研究者在研究与MEK抑制剂的组合疗法。
[0004] 主要由p53基因自身的失活性突变或等位基因丢失导致的p53通路失活是人类癌 症最普遍的分子缺陷。令人感兴趣的是，在超过95%的黑素瘤病例中，p53座位完整无缺，从 而对黑素瘤肿瘤形成的病因学中p53的致病相关性产生疑问。同时，有越来越多的证据支持 p53在黑素瘤形成中的相关作用。p53缺失与BRAFV600E及活化HRASV12G的黑素细胞特异性 过量表达协同促进小鼠中黑素瘤的产生，而致癌性NRAS与p53缺失协同在斑马鱼中产生黑 素瘤。保持了野生型p53表达的癌症常可W发现替代途径来破坏p53的功能，运可通过上游 调节因子的失调和/或下游效应子的失活来实现。MDM2是编码控制p53水平和功能19的E3泛 素连接酶，其在人黑素瘤中（但仅在3%-5%的有记录的病例中）扩增。最近，MDM4上调也被 鉴定为人黑素瘤中p53功能受损的关键决定因子。
[0005] 其它可W成为治疗性干预的祀标的通路有经典的Wnt信号通路和/或由黑素细胞 谱系特异性转录因子MITF调控的转录网络。MITF诱导基因表达模式，该表达模式通过激活 黑色素生物合成中的重要基因（例如Mclr ,Tyr ,Dct和化P-I)和黑素体形成中的重要基因 (例如化el)，促进黑素细胞分化和起始色素产生。重要的是，M口F水平和/或其转录活性的 失调对黑素瘤的发生具有贡献。据此提出了MITF作用的变阻器模型，其中MITF的较高表达 与增殖相关，而较低的MITF水平与转移/入侵及衰老相关。在10-20%的转移性黑素瘤中发 现的MITF扩增/过量表达，与5年存活率的降低相关。MITF的一个关键的促致癌作用设及其 能够通过促进抗调亡基因8化-2的表达来促进黑素瘤生存。Wnt/e-联蛋白信号转导直接调 控MITF的表达，Wnt/e-联蛋白信号转导的组成型激活可W增强黑素瘤细胞的增殖(伴随着 MITF依赖性的产克隆生长的增加），提示该通路是黑素瘤发展的促进因子。
[0006] 由于其获得抗药性的能力、其化学抗性，也因为黑素瘤是一种高度变化和遗传上 异质的肿瘤，迫切需要新的治疗策略和组合疗法。事实上已经有几个针对黑素瘤的编码蛋 白质的治疗祀标被鉴定出来，包括MAP激酶通路的组分，例如BRAFV600E、MEK W及p53通路的 调节子MDM4。然而，运些分子的祀向仍仅适用于有限数量的病例(例如，对抗携带BRAFV600E 突变或过量表达MDM4并含有野生型TP53的肿瘤）。
[0007] 找到不限于一小部分病例或依赖于特定突变存在的新型祀标，将是有利的。此外， 如果运些祀标特异针对黑素瘤细胞坏存在于黑素细胞中）将是有利的，由此它们的抑制将 导致选择性杀死黑素瘤细胞。 发明概要
[0008] 作为最致命的人类癌症之一，黑素瘤在原发性肿瘤的体积小至1立方毫米时就能 够进行远距离和致命的转移。目前，缺少便于检测良性和恶性黑素细胞坏死间的差异和有 助于预知其生物学行为的分子标记。
[0009] 此外，目前对于转移性黑素瘤没有有效的长期治疗方法。黑素瘤由激活有丝分裂 原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导的突变（即服AFV600E，NRASQ6化)驱动。MEK或E服的失活对 于杀死黑素瘤细胞非常有效，不幸的是，许多正常细胞的生长和生存也依赖于MAPK信号转 导，从而使得肥1(和6服抑制剂对患者具有非常大的毒性。
[0010] 祀向活化的BRAFV600E可W导致前所未有的、显著的和快速的肿瘤消退，该情形在 几个月后重新恶化，并由于激活其它因子中的突变而具有抗性，其中所述突变导致可W绕 开MAPK信号转导中对活化BRAF的需要。可W避开因祀向MAPK通路的特定组分而引起的遗传 抗性和与正常细胞中MAPK失活相关的毒性的一个可替代策略，是鉴定仅作用于黑素瘤细胞 (而不作用于正常细胞)且独立于MAPK信号转导的激活方式的疗法。
[0011] 本文描述了一个长链非编码RNA，该长链非编码RNA转录自LINCOl212 aka RPll-460N16.1基因，在绝大多数的黑素瘤中表达(不在正常/非转化的黑素细胞或其它肿瘤类型 中表达），且不管MAP激酶如何被激活(BRAF或NRAS突变或MEK激活）W及TP53是野生型还是 突变的，其都对黑素瘤细胞的生存是必需的。
[0012] 敲低化D)该IncRNA可W诱导黑素瘤细胞调亡而不依赖于TP53的状态（运与例如 MDM4的治疗性抑制形成对照，后者仅在TP53为野生型时才能成功)且不依赖于MAP激酶通路 如何被激活。
[0013] 不束缚于特别的机制，可W看出，LINC01212 KD导致经典Wnt通路的关键组分MITF (及其一些祀标例如DCT、TYRP1)及MEKl和MEK2的下调，伴随着p53/p63信号转导通路的激 活、W及关键的促调亡/肿瘤抑制子p53/p63祀标例如BAX、APAF-1、PUMA、GADD45A或PERP的 表达诱导。
[0014] 运为治疗黑素瘤W及那些不具有例如BRAF V600E突变特征的黑素瘤提供了巨大 潜力。
[0015] 本发明的一个目标是，提供LINCO1212基因功能性表达的抑制剂。运种抑制剂可W 在DNA水平或在RNA(即基因产物)水平上起作用。由于LINC01212是非编码基因，该基因没有 蛋白质产物。
[0016] 根据另一个方面，提供LINC01212功能性表达的抑制剂用作药物。根据另一个方 面，提供LINC01212功能性表达的抑制剂用于治疗癌症，尤其是皮肤癌(例如BCC、SCC)。在另 一个实施方案中，提供抑制剂用于治疗黑素瘤。
[0017] 运等于说是提供了治疗有需要的受试者的黑素瘤的方法，该方法包括对所述受试 者施用LINC01212功能性表达的抑制剂。
[0018] 抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LINC01212基因的功能性表达 即可。根据特定的实施方案，抑制剂选自旨曰91116'、3111?熱、311?熱^1?18?1?^41^6晒^锋指核酸 酶。
[0019] 根据可选但非唯一的特定实施方案，抑制剂选择性地诱导黑素瘤细胞调亡。运特 别是指，其诱导黑素瘤细胞调亡但不诱导非正常（非转化的）黑素细胞调亡。根据其它特定 的实施方案，抑制剂诱导调亡不依赖于p53、BRAF、NRAS或MEK的状态，例如不依赖于运些蛋 白是否具有特定的突变，或不依赖于它们的表达水平。
[0020] 即使LINC01212的抑制足W实现治疗效果，即实现癌症细胞的调亡，本文显示，当 施用LINC01212的抑制剂与其它化疗剂时，可W获得更强的协同效应。运对于B-raf激酶抑 制来说尤其如此。
[0021] 根据另一个方面，提供了可鉴别肿瘤是否适于WLINC01212功能性表达的抑制剂 治疗的方法。运些方法通常具有W下步骤：
[0022] -测定肿瘤或肿瘤细胞样品中LINC01212的表达是否增加；
[0023] -确立肿瘤是否适于治疗，其中增加的表达是治疗适宜性的指示。
[0024] 表达的增加通常是与合适的对照的比较，所述对照例如对照细胞群体，诸如但不 限于皮肤细胞或非转化的黑素细胞。值得注意的是，如果对照不表达LINC01212,则只要样 品中存在LINCO1212 RNA就相当于增加的表达。
[0025] 因此，运些方法可能需要提供肿瘤细胞样品的第一步骤。测定步骤可W完全在体 外进行，即，没有在人或动物身体上相互作用的步骤。
[0026] 根据特定的实施方案，肿瘤是黑素瘤。
[0027] 根据特定的实施方案，在确定肿瘤适于治疗后，方法还可W包括对存在肿瘤的受 试者施用LINCO1212功能性表达抑制剂的步骤，W治疗肿瘤。
[0028] 本文还提供了在受试者中诊断黑素瘤的存在的方法，包括W下步骤：
[0029] -测定所述受试者的样品中LINC01212的水平；
[0030] -将所述样品中LINC01212的水平与黑素瘤的存在相关联。
[0031] 在该方法中，LINC01212的存在(或增加的表达)指示，样品所取自的受试者存在黑 素瘤。，尽管不一定要排除体内的方法，但典型地运些方法在体外进行。通常通过测定所述 样品中LINCO1212 RNA的水平来确定LINCO1212的水平。
[0032] 样品可W是组织样品（例如皮肤biopt)，但是，如本文中示，在黑素瘤患者中， LINC01212也在血液中循环。因此，也可W在血液或血清中检测LINC01212,由此，样品可W 是血液样品或血清样品。
[0033] LINC01212 RNA的水平随着疾病的不同阶段而变化（图6)。因此，在确定黑素瘤存 在的方法中，可W包括另外的步骤，该步骤将LINC01212的水平与疾病的严重程度、疾病阶 段(例如黑素瘤阶段)或疾病进展关联起来。
[0034] 附图简述
[0035] 图I显示MITF座位下游LINC01212基因的长转录物的arrayCGH分析。
[0036] 图2:不同细胞系中LINC01212基因的表达分析，突出了黑素瘤细胞系和正常的人 表皮黑素细胞(NHEM)。
[0037] 图3:LINC01212表达的长同种型的热图，基于来自TCGA的>200个人黑素瘤样品的 RNA-se