用于生物合成异丁烯酸盐的方法
【专利说明】用于生物合成异T稀酸盐的方法 发明领域
[0001] 本发明设及用于生物合成异下締酸盐的方法，且更具体而言设及使用一种或多种 分离的酶(诸如一种或多种硫醋酶、脱氨酶或转移酶)或使用表达一种或多种此类酶的重组 宿主细胞合成异下締酸盐。
[0002] 发明背景
[0003] 异下締酸盐(methac巧late)(2-甲基丙締酸)是一种广泛用于异下締酸醋，诸如异 下締酸甲醋或聚（异下締酸甲醋）（其用于生产透明的聚异下締酸甲醋丙締酸塑料）的中间 体。异下締酸盐可W通过各种路径合成，包括通过使用硫酸将丙酬合氯化氨（acetone cyanohydrin)转化为硫酸甲基丙締酷胺W及水解成异下締酸，通过将异下締氧化为异下締 醒(其被氧化为异下締酸），或者通过异下酸的脱氨。参见例如Bauer, "Methacrylic Acid and Derivatives，'in Ullmann'S Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002 ,Wiley-VCH，Weinheim。因而，需要用于生成异下締酸盐的生物合成方法W避免使用危险的化学品。
[0004] 发明概述
[0005] 本公开内容至少部分基于用于生物合成异下締酸盐的酶促系统和重组宿主的开 发，所述异下締酸盐是一种可用于生产异下締酸醋或聚（异下締酸甲醋）醋类，诸如异下締 酸甲醋或聚（异下締酸甲醋）的中间体。特别地，如本文中描述的，可W自可再生给料生物合 成生成异下締酸盐。异下締酸盐的生成经由异下酷基CoA进行。术语"异下締酸盐"和"异下 締酸"在本文中可互换使用，指任何其中性或离子化形式的相同化合物，包括其任何盐形 式。本领域技术人员理解具体的形式会取决于pH。
[0006] 在一个方面，本文件特征在于生成异下締酸盐的方法。该方法包括从丙酬酸酶促 合成异下締酷基-CoA,并且使用硫醋酶或CoA-转移酶将异下締酷基-CoA酶促转化为异下締 酸盐。硫醋酶可W在EC 3.1.2.-下分类，并且可W是tesB或化iA的基因产物。CoA-转移酶可 ^在6〔2.8.3.-下分类，并且可^具有66油3证登录号〔4877207.1(沈9 10^:4)。
[0007] 本文件的特征还在于生成异下締酸盐的方法。该方法包括自丙酬酸酶促合成异下 醒，并且将异下醒酶促转化为异下締酸盐。可W使用苯乙醒脱氨酶、异下醒脱氨酶或乳醒脱 氨酶将异下醒转化为异下酸，可W使用CoA转移酶或连接酶将异下酸转化为异下酷基-CoA, 可W使用脱氨酶将异下酷基-CoA转化为异下締酷基-CoA,并且可W使用硫醋酶或CoA转移 酶将异下締酷基-CoA转化为异下締酸盐。苯乙醒脱氨酶可W在EC 1.2.1.39下分类。例如， 苯乙醒脱氨酶可W与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。乳醒脱 氨酶可W在EC 1.2.1.22下分类。异下醒脱氨酶可W与SEQ ID N0:6中所列的氨基酸序列具 有至少70%序列同一性。CoA转移酶可W是EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶。例如，丙酸 CoA-转移酶可W与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5.的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。 连接酶可W是EC 6.2.1.13下分类的丙酸CoA连接酶。
[000引在一个方面，本文件特征在于生成异下締酸盐的方法。该方法包括使用硫醋酶或 CoA-转移酶将异下締酷基-CoA酶促转化为异下締酸盐。硫醋酶可W在EC 3.1.2.-下分类。 例如，硫醋酶可W是tesB或YciA的基因产物。硫醋酶可W与SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序 列具有至少70 %序列同一性。Co A-转移酶可W在EC 2.8.3.-下分类。例如，Co A-转移酶可W 与SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5.的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。可W从丙酬酸酶 促合成异下締酷基-CoA。例如，可W使用例如一种或多种下述酶，自丙酬酸经由异下醒酶促 合成异下締酷基-CoA:乙酷乳酸合酶;二径基异戊酸脱氨酶;2，3-二径基异戊酸脱水酶;2-氧代戊酸脱酸酶;苯乙醒脱氨酶，异下醒脱氨酶或乳醒脱氨酶;或CoA转移酶或连接酶;或酷 基-CoA脱氨酶。也可W使用例如一种或多种下述酶，经由2-氧代-异戊酸至异下酷基-CoA的 转化自丙酬酸酶促合成异下締酷基-CoA:乙酷乳酸合酶;二径基异戊酸脱氨酶;2，3-二径基 异戊酸脱水酶;支链脱氨酶;或酷基-CoA脱氨酶。连接酶可W是EC 6.2.1.13下分类的丙酸 CoA连接酶。酷基-CoA脱氨酶可W是异下酷基-CoA脱氨酶，例如，与SEQ ID N0:7或SEQ ID NO: 9中所列的氨基酸序列具有至少70 %序列同一性的异下酷基-CoA脱氨酶。
[0009] 本文中描述的任何方法可W在重组宿主(例如原核生物或真核生物）中进行。宿主 可W经受厌氧、需氧或微需氧培养条件下的培养策略。可W经由氮、憐酸盐或氧限制在营养 物限制的条件下培养所述宿主。可W使用陶瓷中空纤维膜保留所述重组宿主细胞W在发酵 期间维持高细胞密度。补料到发酵的主要碳源可W源自生物或非生物给料。生物给料可W 是或可W源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素诸如乙酷丙酸和慷醒、木 质素、甘油=醋例如甘油和脂肪酸、农业废物或城市废物。非生物给料可W是或可W源自天 然气、合成气、0)2/此，甲醇，乙醇，非挥发性残留物(NVR)或来自环己烧氧化过程的碱洗液 (caustic wash)。
[0010] 在本文中描述的任何方法中，可W经由在选择性环境中的连续培养改善所述宿主 对高浓度的异下締酸的耐受性。
[0011] 在本文中描述的任何方法中，可W在所述宿主中减弱导致并且包含异下締酸的中 屯、代谢物和中屯、前体的内源降解途径。
[0012] 在本文中描述的任何方法中，可W通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者 提高异下締酸的任何关联转运蛋白活性增强或放大异下締酸穿过细胞膜到胞外介质的流 出。
[0013] 本文件的特征还在于重组宿主，其包含至少一种编码苯乙醒脱氨酶的外源核酸， 其中所述重组宿主生成异下締酸。苯乙醒脱氨酶可W在EC 1.2.1.39下分类。宿主可W进一 步包含编码丙酸CoA转移酶的外源核酸。宿主可W进一步包含编码丙酸CoA连接酶的外源核 酸。宿主可W进一步包含编码化iA或tesB的基因产物的外源核酸。
[0014] 本文件的特征还在于重组宿主，其包含至少一种编码苯乙醒脱氨酶的外源核酸， 其中重组宿主生成异下締酸。苯乙醒脱氨酶可W在EC 1.2.1.39下分类。例如，苯乙醒脱氨 酶可W与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。宿主可W进一步包 含下述外源酶中的一种或多种(例如1、2、3、或4):丙酸CoA转移酶、丙酸CoA连接酶、硫醋酶 和异下酷基-CoA脱氨酶。丙酸CoA转移酶可W与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列 具有至少70%序列同一性。硫醋酶可W是YciA或tesB的基因产物。硫醋酶可W与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或沈Q ID N0:3的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。异下酷基-CoA 脱氨酶可W与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0015] 任何重组宿主或任何方法中使用的任何重组宿主可W是原核生物。原核生物可W 来自埃希氏菌属（Escherichia)如大肠杆菌（Escherichia coli);来自梭菌属 (Clostridia)如杨氏梭菌（Clostridium I jungdahlii)、自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒状杆菌属 (Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属 (C叫riavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator)或者耐金属贪铜菌（Cupriavidus metallidurans);来自假单胞菌属（Pseudomonas )如巧光假单胞菌（Pseudomonas f Iuorescens)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)或者食油假单胞菌（Pseudomonas oleavorans);来自代尔夫特菌属(Delftia)，食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans);来 自芽抱杆菌属（Bacillus)如枯草芽胞杆菌（Bacillus subtillis);来自乳杆菌属 化actobacilIus)如德氏乳杆菌化actobacillus deIbrueckii );或者来自乳球菌属 (Lactococcus)如乳酸乳球菌(Xactococcus Iactis)或来自红球菌属（I^iodococcus)如马 红球菌（I^hodococcus equi)。
[0016] 任何重组宿主或任何方法中使用的任何重组宿主可W是真核生物。所述真核生物 可W来自曲霉属（Aspergillus)如黑曲霉（Aspergillus niger);来自酵母属 (Saccharomyces)如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);来自毕赤氏酵属（Pichia)如 己斯德毕赤酵母(Pichia pastoris);来自耶罗维亚酵母属(