针对膀胱癌的dna甲基化生物标志物的制作方法_3

文档序号:9924955阅读:来源:国知局
Y、IRAK3、Ll-MET和Z02中的一种或多种的DNA表达水平。生成了接受者操作特性 (ROC)曲线,其汇总了来自对照受试对象的测试样品中的DNA标志物的准确度,所述对照受 试对象之前已被诊断具有膀脫癌。优选在至少一种W下时刻选择测试样品:(1)诊断时;(2) TURBT后最近一次随访时(非复发患者)或第一次复发时(TURBT后复发的患者)。优选的是, 仅将具有所有标志物的完整数据的患者子集用于产生风险评分作为多变量预测模型。
[0058] 应当使用对数据的逐步式逻辑回归分析,基于赤池信息量准则(AIC)来选择要加 入或减去的变量。AIC是用于模型选择的最优性准则。当比较两种模型时,优选AIC最低的模 型。发明人将无变量的模型的AIC与所有1-变量模型的AIC进行了比较,并加入了最大地减 小AIC的变量。通过加入进一步减小AIC的下一个变量来重复进行该过程。再重复一次该正 向步骤,并加入评估除去已存在于模型中的一种变量的可能性的反向步骤。对于每个新步 骤,都考虑了变量的加入/除去,从而提供了 "步进(stepping)"通过具有不同变量组合的模 型的手段,W寻找最佳的预测模型。当发现AIC最低的模型时,该程序终止。
[0059] 使用逻辑回归获得的风险评分代表了阳性结果(复发)在优势对数标度上的概率。 W此优选标度,0分表示患者具有复发的概率为0.5(50%几率)。运表明,预测复发的风险评 分的最佳阔值为0,评分大于加寸来自复发患者的几率大于50%,评分小于加寸来自复发患者 的几率小于50 %。
[0060] 灵敏度和特异性可W使用5倍交叉验证对每个数据子分区重复进行模型选择来估 算。使用5倍交叉验证来获得灵敏度和特异性的报告(偏重较小的)估算值。使用对4/5的数 据集进行的正向和反向逐步选择来进行模型选择,并且对未用于变量选择的第五个数据集 (独立的数据子集)评估预测能力。优选的是,将上述过程重复进行五次,每次都留出数据集 的单独的1/5用于验证,并对其余的4/5进行新的模型选择。
[0061] 本发明的一个或多个实施方式可W在计算机上实施。例如,可W用计算机来推导、 执行、储存或处理DNA甲基化水平、统计学分析、比较和风险评分中的任一种或多种。此外, 同样可W用计算机来推导、分析或汇报任何确定或评估结果。不论用什么平台,计算机的类 型都不受特别限制。例如,计算机系统通常包括一个或多个处理器、相关的存储器(例如,随 机存取存储器(RAM)、超高速缓冲存储器、闪速存储器等)、储存设备(例如硬盘驱动器、光驱 (例如CD驱动器或数字激光视盘(DVD巧E动器)、闪存棒、磁光盘、固态驱动器等)和当今的计 算机或任何其他未来计算机(未示出)中的常见的多种其他元件和功能器件。每个处理器可 W是中央处理单元,并且可W是或不是多核处理器。计算机还可W包括输入装置,例如键 盘、鼠标、输入板、触摸屏、麦克风、数字相机、显微镜等。此外,计算机可W包括输出装置,例 如监视器(例如液晶显示器化CD)、等离子显示器或阴极射线管(CRT)监视器)。计算机系统 可W通过有线或无线的网络接口连接(未示出)而连接至网络(例如,局域网(LAN)、广域网 (WAN)(例如互联网)或任何其他类型的网络)。本领域技术人员会认识到,存在很多不同类 型的计算机系统,且上述输入和输出装置可W采用其他形式,包括手持设备,例如输入平 板、智能手机、Slate平板、平板电脑、PDA等。通常而言,计算机系统至少包括实施本发明的 实施方式所必须的最低限度的处理装置、输入装置和/或输出装置。
[0062] 此外,本领域技术人员会认识到,上述计算机系统的一种或多种元件可W位于远 程位置并通过网络与其他元件相连。此外,本发明的实施方式可W在具有多个节点的分布 式系统上执行,其中本发明的每个部分可W位于该分布式系统内的不同节点上。在本发明 的一个实施方式中,节点对应于计算机系统。作为另一选择,节点可W对应于带有相关物理 存储器的处理器。节点还可W是具有共享存储器和/或资源的处理器或处理器微核。另外, 用来执行本发明的实施方式的计算机可读程序代码(即软件指令)可W储存在计算机可读 介质上。计算机可读介质可W是有形的计算机可读介质,例如光盘(CD)、软盘、磁带、闪存设 备、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)或任何其他有形介质。
[0063] 因此,本发明的实施方式设及一种系统,所述系统包括:非暂时性计算机可读介 质,所述介质包含储存在其中的计算机可读程序代码,所述程序代码用于使处理器获得测 试样品中的册乂49、50乂1、胖¥、11?41(3、1^-]\161和202中的一种或多种的测得的0魁甲基化水 平;和将所述测试样品中的所述一种或多种生物标志物的DNA甲基化水平与源自对照组的 所述一种或多种生物标志物的参比DNA甲基化谱进行比较,所述对照组的成员具有膀脫癌。 在优选实施方式中,基于比较产生了报告,该报告提供了关于W下(1)、(2)和(3)之一的指 导:(1)膀脫癌是否已复发;(2)是否存在膀脫癌复发的风险;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0064] 因此,本发明的另一实施方式设及一种系统,所述系统包括:非暂时性计算机可读 介质,所述介质包含储存在其中的计算机可读程序代码,所述程序代码用于使处理器获得 测试样品中的H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3、L1-Met和Z02中的两种或多于两种的测得的DNA甲基 化水平;和计算风险评分。在优选实施方式中,基于风险评分而产生了提供关于W下(1)、 (2) 和(3)之一的指导的报告:(1)膀脫癌是否已复发;(2)是否存在膀脫癌复发的风险;和 (3) 患者是否具有膀脫癌。
[0065] 本发明的另一实施方式是测试试剂盒,可选地还附有书面说明书,该说明书用于 对相关比较或风险评分进行评估,从而诊断或辅助诊断患者的膀脫癌复发或预测受试对象 膀脫癌复发的可能性。
[0066] 本发明的试剂盒包括用于执行W下操作所必需的一种或多种试剂(可选地还附有 用于执行下操作的适当的说明书):从测试样品中提取DNA,所提取的DNA的亚硫酸氨盐转 化,对关注区域的PCR扩增,对所扩增的关注区域的焦憐酸测序,和测量甲基化胞喀晚的百 分比。举例而言,可W使用例如EZ DNA甲基化试剂盒(幻mo Research)根据制造商的操作说 明来对测试样品中的DNA进行亚硫酸氨盐转化。所关注的区域可W使用表4中的生物素标记 的引物来进行PCR扩增,并通过焦憐酸测序来分析,焦憐酸测序是用于DNA序列检测的高通 量定量工具。甲基化胞喀晚的百分比为甲基化的胞喀晚数量除W甲基化与未甲基化胞喀晚 的总和。
[0067] 本发明的DNA甲基化标志物还可W与能够预测进展的其他已知标志物组合使用, 由此增加其预测准确性。
[006引实施例
[00例实施例1:尿沉淀物中的生物标志物的DNA甲基化状态反映出肿瘤的相应DNA甲基 化状态。发明人之前示出,H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3和Z02在膀脫肿瘤样品中高甲基化 (Wolff,化ihara等,2010)。此夕h证明了在肿瘤W及附近的正常组织中出现了 Z02高甲基化 或Ll-MET低甲基化(表观遗传学视场缺陷),运可能有助于肿瘤复发(Wolff ,Byun等,2010, Wolff ,Chihara 等,2010)。为了评估 H0XA9、S0X1、NPY、IRAK3 和 Z02 的高甲基化和 Ll-MET 的低 甲基化是否还可W在尿沉淀物中检测到,发明人使用焦憐酸测序分析了从具有膀脫肿瘤的 患者(n = 20)和年龄匹配的无癌症对照(n = 20)收集到的尿样。结果显示,与健康供体相比, 在来自癌症患者的尿沉淀物中,H0XA9(p<0.0001)、SOXl (P = 0.00 17)、NPY(p = 0.005)、 IRAK3(p<0.0001)和 Z02(p<0.0001)的 DNA 甲基化水平显著升高,而 Ll-MET(iKO.OOOl)的甲 基化显著降低,运表明尿沉淀物中的运些DNA甲基化和表观遗传学视场缺陷标志物的甲基 化状态反映了肿瘤的相应甲基化状态(图5)。
[0070]实施例2:选定的生物标志物的甲基化状态与膀脫癌的复发显著相关且具有预测 价值。为了调查尿沉淀物中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、Z02 (高甲基化)和L1 -MET (低甲基化) 的异常DNA甲基化是否与肿瘤复发相关,发明人首先分析了它们在于随访时从已经历肿瘤 切除的患者中收集的368份尿沉淀物中的DNA甲基化状态(图1A),并计算了每种标志物的 DNA甲基化水平的Spearman相关性(图6)。在所有样品范围内,单独的DNA甲基化标志物成功 率平均为98.9% (范围=94.9%~100%)。接下来,将在第一次复发时收集自患者的31份尿 沉淀物中的上述标志物的DNA甲基化状态与来自在研究期间未复发的患者在最后一次随访 时的56份样品中的相应DNA甲基化状态进行比较。结果显示,六种候选标志物单独地显示出 了在复发检测方面的高灵敏度和特异性,运可W由ROC曲线和AUC值证明,所述AUC值为0.93 (册 乂49)、0.95(50乂1)、0.94(^¥)、0.9(1尺41(3)、0.93(202)和0.95化1-]\^1')(口<0.0001;图 1B)。标志物甲基化分析示于表3中。在无膀脫肿瘤复发的患者组中,尿沉淀物样品显示了在 整个监视随访期间始终一致的DNA甲基化水平;膀脫癌肿瘤中甲基化的所有标志物都显示 出了较低的甲基化水平,而在膀脫癌中低甲基化的标志物化1-MET)则在TURBT后保持了高 甲基化水平(图1C,患者7873和9214)。相比之下,在临床定义的复发时,具有膀脫癌肿瘤复 发的患者组显示出全部六种标志物的DNA甲基化状态变化。例如,在患者7258中,高甲基化 的标志物80乂1、肥¥、1341(3和202的0臟甲基化水平持续升高,一直到在获得第一份尿样后19 个月W阳性膀脫镜检和活检结果确认了复发。在切除术后,可W看到之前升高的甲基化水 平有所降低(图1D)。在患者7145中观察到了相似的轨迹;但是,第一次复发时测得的总体甲 基化水平在再次TURBT后6个月和9个月的随访时仍然保持不变。运表示复发的肿瘤未完全 除去,因为在运些随访中记录了疑似的细胞学(图ID)。结果证明了册XA9、SOXl、NPY、IRAK3、 Z02的高甲基化和Ll-MET的低甲基化与疾病复发相一致。此外,在随访时获得的样品中,运 些标志物的甲基化水平表现出了确认复发的清楚趋势:高甲基化的标志物继续升高,而低 甲基化的标志物则下降(图1D)。总而言之,运些结果证明了运些标志物在尿沉淀物中的甲 基化状态不仅显示出了与复发的显著相关性(P<〇.0001),而且具有预测价值,因为甲基化 变化可W在复发的临床证据之前检测到。
[007。 实施例3:选定的生物标志物能够检测疾病复发且灵敏度和特异性高。为了确定能 够W高灵敏度和特异性在尿沉淀物中检测肿瘤复发的标志物组合,发明人建立了多标志物 模型,并用在TURBT后第一次复发时获取的29份样品和来自最后一次采集尿液时无复发的 患者的54份样品测试了该模型。由该模型发现,S0XUIRAK3和Ll-MET是可W得到的最佳标 志物组合(风险评分=-0. 37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET)。大 于0的评分预示着复发。在来自无复发患者的54份样品中,发明人发现94%的病例显示出了 负分(低于阔值的甲基化评分),而3个病例显示出正分(5.6%)。重要的是,在来自复发患者 的29份样品中,93 %显示出了对应于复发的正分(p<0.0001;图2A)。此外,经五倍交叉验证 分析评估,运些标志物能够W86%的灵敏度和89%的特异性区分复发和无复发的患者(图 2B)。随后使用发明人的研究组群中的其余的样品验证了该=基因模型:23个样品取自存在 膀脫肿瘤时的随访(TU,第一次复发后的9个复发样品,和在进入该研究时的14个样品),135 个样品来自在给定的随访期期间未发展癌症的患者(CU)。值得注意的是,在验证样品组中 该=标志物模型还显示出高灵敏度(83%)和特异性(97%):来自无复发患者的131个尿沉 淀物样品显示出甲基化负分,而取自具有肿瘤的患者的19个尿沉淀物样品显示出甲基化正 分(图2C;p<0.0001)。除肿瘤复发外,本发明的S标志物模型的DNA甲基化状态未显示出与 任何原发性肿瘤特征的相关性;然而,在DNA甲基化状态和复发的肿瘤的肿瘤阶段之间发现 了正相关(表5)。运些结果证明,两种肿瘤特异
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