一种cd24抗体融合蛋白的设计及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可同时与白细胞分化抗原CD24 (cluster of different iat ion 24)和NKG2D受体特异性结合的⑶24抗体融合蛋白rG7S_ MICA，其利用rG7S的靶向性将MICA特异性地展示于肿瘤细胞表面，避免了由于细胞表面 MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸。在体内外试验中，CD24+肝癌细胞Huh-7表 面的MICA通过MICA-NKG2D信号通路有效募集并激活NK细胞，诱导其释放穿孔素-颗粒酶，分 泌IFN-y、TNF-a等多种细胞因子，有效杀伤肿瘤细胞并抑制其生长。rG7S-MICA的设计开辟 了 一种新的肿瘤免疫治疗策略，是一种特异性重塑NK细胞对CD24+肿瘤细胞免疫监视功能 的双功能抗体融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 当今全球恶性肿瘤发病率及死亡率一直呈上升趋势。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞 表面标记物脱落导致其逃脱免疫监视，这也是放化疗法常产生耐药和低安全性评价的瓶颈 所在。因此，寻找特异性的分子靶标与新颖的临床用药手段是肿瘤个性化治疗的关键。肿瘤 免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，利用"生物导弹"将机 体中天然存在的免疫细胞这种弹药特异性地募集至肿瘤病灶部位，该策略具有高特异性与 低副作用的优势。
[0003] 肿瘤相关性抗原MICA
[0004] MICA(MICA,major histocompatibility complex class I chain-related gene A)是一种高度糖基化的蛋白质分子，属于非经典HLA-I (human leucocyte antigen-I)类基 因家族。MICA广泛且特异性地表达于上皮来源的原发性肿瘤细胞中，是一种公认的肿瘤相 关性抗原。NK细胞或CD8+T细胞借表面受体NKG2D与配体MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠 近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解。虽然证实MICA分子表达于多种肿 瘤细胞表面，但MICA的脱落导致肿瘤细胞虽然仍属于MICA阳性，但却能避开免疫监视并导 致免疫逃逸。因此寻找一种新的展示方式以重塑MICA在肿瘤免疫监视中的作用成为肿瘤免 疫治疗策略的关键，抗体是激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规靶向药物，其中单链 抗体由于其分子量小更容易通过血脑屏障到达病灶部位而更多地用于此类靶向设计。由此 我们提出一种假设:将MICA分子与抗体融合，借助于靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体对肿瘤 细胞的识别和结合，MICA被锚定于肿瘤细胞表面;进一步通过MICA与NKG2D的结合刺激NK细 胞杀伤肿瘤细胞，重建由NKG2D途径激活机体自身的免疫监视作用。
[0005] NKG2D分子是C型凝集素样受体家族的一种同源二聚体II型跨膜蛋白。在肿瘤的生 长进程中，MICA等配体下调或蛋白水解脱落会抑制NK细胞介导的免疫调控，而诱导NKG2D的 配体在肿瘤细胞表面的表达会使肿瘤细胞更容易被NK细胞识别和杀伤。NKG2D通路活化效 应细胞的分子机制:NKG2D与其配体结合，辅以接头蛋白分子DAP 10或DAP 12的帮助，激活下 游信号通路，最终活化NK细胞。
[0006] 肿瘤标志物CD24分子
[0007] 经文献调研发现白细胞分化抗原⑶24(cluster of differentiation 24)作为一 种潜在的致癌因子，在结直肠癌、乳腺癌、肝癌、小细胞肺癌等多种肿瘤组织中过表达，而在 正常组织中不表达或低表达。基于CD24分子肿瘤细胞标记物的特点，我们提出CD24抗体作 为有效的载体连接MICA分子，激活NKG2D途径，重塑NK细胞的免疫监视作用。科学家致力于 该类型靶点设计抗体融合蛋白，这些肿瘤表面抗原都具有与CD24相同的特点：1.肿瘤细胞 表面高表达;2.正常组织细胞表面不表达或低水平表达。
[0008] 免疫细胞天然配体和抗体的融合蛋白
[0009] 目前已经有很多针对抗体融合蛋白的开发，其设计方式为：1.利用靶向CD138、CEA 的单链抗体连接NKG2D配体效应分子制备"生物导弹"，有效募集NK细胞至肿瘤病灶部位，杀 伤肿瘤细胞;2.利用CD20单链抗体连接MICA设计抗体融合蛋白，以有效治疗淋巴瘤;3.采用 化学偶联的方式将靶向CD20单抗的Fab片段与MICA相连，有效增强NK细胞对CD20阳性肿瘤 细胞的识别与杀伤作用。至今鲜有NKG2D配体MICA分子相关融合蛋白的报道。
[0010] 通过CD24单链抗体与MICA分子相连接构建融合蛋白，可以显著加强NK细胞得免疫 监视作用。NK细胞在肿瘤免疫监视中起到关键性作用，NK细胞的激活取决于其表面的NKG2D 等活化性受体。阳性表达CD107a分子是具有杀伤活性NK细胞的标记物。NK细胞主要的活化 性受体包括NKG2D、Fc y Rllla和天然细胞毒受体(NCRs)，免疫配体募集并激活NK细胞的效 应功能，活化后的NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶，同时分泌细胞因子IFN- y和TNF-a来调 节效应细胞功能。因此，NK细胞在特异性杀伤肿瘤细胞的新型治疗手段中成为了一个很有 前景的武器。
[0011]基于上述理论基础与科研实践，本发明将已具有自主知识产权的抗⑶24单链抗体 G7S与MICA通过柔性肽连接，设计一种新型重组蛋白rGTS-MICA^GTS-MICA的设计开辟了一 种新的肿瘤免疫治疗策略。该研究一方面重塑NKG2D途径诱导的NK细胞免疫监视，通过激活 机体自身免疫功能有效杀伤肿瘤；另一方面该治疗方案发挥靶向性优势，有效降低化放疗 药物产生的毒副作用，在临床前研究与临床安全性评价中将会占据制高点。因此，具有自主 知识产权的融合蛋白rG7S-MICA的开发，为肿瘤免疫治疗体系提供新颖的临床用药方案。
【发明内容】
[0012]发明目的
[0013]本发明提供一种具有抗肿瘤免疫疗效的CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA。本发明抗 体融合蛋白的特征为G4S柔性肽Linker连接rG7S与MICA分子，保留了二者原有的亲本活性； 哺乳动物细胞表达系统进行蛋白表达，保证融合蛋白的生物活性；利用rG7S的靶向性将 MICA特异性地展示于⑶24+肝癌细胞Huh-7表面，避免了由于细胞表面MICA分子表达下调与 脱落引起的肿瘤免疫逃逸;激活NK细胞并诱导其分泌IFN-y、TNF-a等细胞因子，重塑NK细 胞对肿瘤细胞的免疫监视功能;体内外抑制肝癌细胞Huh-7的生长，其抑瘤效果和安全性明 显优于脂质体阿霉素等化疗药物和阿瓦斯汀等抗体药物。
[0014]技术方案
[0015] 一种⑶24抗体融合蛋白，该融合蛋白以⑶24单链抗体rG7S与人源MICA分子为基 础，运用基因重组等手段，构建成双功能抗体融合蛋白rG7S-MICA。
[0016] rG7S-MICA完整结构的肽链由rG7S重链可变区、rG7S轻链可变区、人源MICA胞外1- 3区和6个氨基酸的组氨酸标签6XHis组成，并且rG7S的轻(重)链可变区域和两种功能蛋白 半分子间(rG7S、MICA)通过柔性肽G4S连接。
[0017] 一种哺乳动物细胞CHO-s分泌表达法，用于分泌表达CD24抗体融合蛋白rG7S- MICA〇
[0018] -种分离的核酸分子，该核酸分子编码抗体融合蛋白rG7S-MICA。
[0019] 一种表达载体，含有⑶24抗体融合蛋白rG7S-MICA目的基因的核酸分子。
[0020] 一种重组宿主细胞，含有上述的表达载体。
[0021] CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA的应用方式:rG7S半分子发挥靶向性作用将MICA半 分子特异性地展示于CD24高表达的肿瘤细胞表面，通过MICA半分子选择性地与NK细胞表面 的NKG2D受体结合，提高机体微环境中NK细胞的靶向识别能力与杀伤作用。
[0022] CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA在治疗肿瘤药物中的应用。
[0023]发明进一步说明：
[0024] 本发明中CD24单链抗体/MICA双功能融合蛋白rG7S-MICA的肽链由rG7S重链可变 区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、rG7S轻链可变区、5个氨基酸的柔性肽(GGGGS)、人源MICA 分子和6个氨基酸的组氨酸标签(HHHHHH)依次组成。
[0025]本发明的一个目的是构建CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA的表达载体，筛选该抗体 融合蛋白高表达的工程细胞株，提供一种可以稳定高表达和批量纯化上述CD24抗体融合蛋 白rG7S-MICA的方法;本发明的另一个目的是建立CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA的体内外药 效评价体系，评估肿瘤免疫治疗方案的可行性。
[0026] 本发明利用overlap PCR(polymerase chain reaction)技术将本实验室筛选获 得的CD24单链抗体的轻链可变区C端与人源MICA胞外1-3区基因辅以柔性肽G4S相连接，进 行克隆重组，构建抗体融合蛋白rG7S-MICA重组载体，通过电穿孔法稳定转染CHO-s细胞，经 两轮G418加压筛选获得正确表达rG7S-MICA的稳定工程细胞株;使用HisTrap亲和层析柱分 离纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测纯化产物为电泳纯，Western Blot鉴定表达产物表达及装 配正确;MST(Microscale Thermophoresis)技术分析测定rG7S_MICA的亲和力常数(KD)为 19.8 ± 2.63nM，与母体单链相当，同时rG7S-MICA可以有效地和NKG2D结合，亲和力常数为 100±6? 34nM;FCM(flow cytometry)结果揭示了抗体融合蛋白可与多种CD24+肿瘤细胞结 合;细胞毒性裂解试验以NK-92或PBMC(peripheral blood mononuclear cell)为效应细 胞，肝癌细胞株Huh-7为靶细胞，结果表明rG7S-MICA能有效地介导免疫细胞对肿瘤细胞的 特异性杀伤，而亲本单链抗体不具备上述特征;进一步的流式细胞术和ELISA检测结果说 明，rG7S-MICA通过NKG2D途径诱导NK-92细胞脱粒，同时分泌大量细胞因子IFN- Y和TNF-a 以更有效地杀伤靶细胞。
[0027]本发明涉及的体内实验采用荷人肝癌(Huh-7)裸鼠模型验证rG7S-MICA的抗肿瘤 活性，通过免疫组化实验初步验证其体内抗肿瘤机制。给药后通过对皮下移植瘤体积、重量 以及荷瘤裸鼠生存期的测定说明，rG7S-MI CA对裸鼠Huh-7乳腺癌模型具有明显的生长抑制 作用，并能显著延长荷瘤裸鼠的生存期。结果显示低剂量〇 . 5mg/kg rG7S-MICA的抑瘤效果 相当于3.0mg/kg的脂质体阿霉素；中等剂量1.0mg/kg rG7S-MICA的抑瘤效果相当于5.0mg/ kg的阿瓦斯汀;高剂量2.0mg/kg rG7S-MICA的抑瘤效果明显优于上述两种市售药物。
【附图说明】
[0028]图1是基于rG7S的抗体融合蛋白rG7S-MICA的基因重组分析和三维结构预测图， rG