一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微量物质检测技术领域，尤其涉及一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]抗生素是一种由微生物自身产生或人工合成、低浓度下能抑制微生物生产或杀灭其他微生物的有机化学物质，除了用于人类和动物细菌性感染疾病的治疗，抗生素也被作为促长剂和饲料添加剂在集约化畜牧业和养殖业中大量应用，随着大量抗生素的使用，越来越多不能被充分吸收利用的抗生素通过人畜粪便直接排出，这些含抗生素的粪便可通过有机肥料的施用进入农田与植物之间发生迀移，此外这些抗生素有可能通过渗透、径流、淋溶等方式迀移到地表水和地下水中，重新流入环境。
[0003]目前监测抗生素残留检测方法主要有微生物法、免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。微生物法简单快速，但检测限高，特异性差;色谱检测法耗时长、在残留分离检测中，样品前处理过程复杂，并影响分析的准确度;免疫检测法简单、快速，检出限低，可进行大规模筛选，但是其相应抗体的制备需要大量实验动物，而且抗体在恶劣环境下易于失活，影响检测结果。
[0004]此外，还有利用分子印迹固相萃取-高效液相色谱法分析鸡肉中的弗洛喹酮类抗生素如用磁性荧光分子印迹硅纳米球检测人尿液中的环丙沙星或诺氟沙星;磁性分子印迹聚合物固相萃取牛奶中的三种氟喹诺酮类抗生素，并用HPLC进行检测。但目前报道的分子印迹方法都是采用沉淀聚合法合成分子印迹聚合物，反应时间过长，而且合成的聚合物成块状，需要经过长时间的打磨、筛分才能用于固相萃取，分子印迹聚合物利用率不高，此外还需联用HPLC或HPLC-MS等技术，所需仪器贵重。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用，旨在解决现有喹诺酮抗生素检测技术易于失活、检测结果不佳等问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物的制备方法，该方法包括以下步骤:
(I)固相载体玻璃珠上引入抗生素
将250?300 g玻璃珠加入到120?160 mL、l?4 mol/L的NaOH水溶液中，加热沸腾10?15分钟，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH=8?9，烘干得到羟基化玻璃珠；
将羟基化玻璃珠加入到150 mL干甲苯中，再加入3.3mL N_[3_(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，剧烈摇动后，室温下放置过夜，过滤、丙酮冲洗，得到硅烷化玻璃珠；
在20 mL乙腈和80 mL pH 6.0 PBS缓冲溶液中，加入80?120 mg喹诺酮类抗生素、80~100 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和120?150 mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温放置10?15分钟后倒入100 g上述硅烷化玻璃珠中，加I mol/L的NaOH水溶液调节反应液pH至7.4，室温下反应2?3 h，抽滤，水洗，干燥，得到喹诺酮抗生素衍生玻璃珠；
(2)合成喹诺酮类抗生素印迹的纳米印迹聚合物
将8.0?10.0 mmol甲基丙稀酸、4.0?5.0 mmol乙二醇二甲基丙稀酸酯、3.0 ~3.5mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、1.0 mmol 二乙基二硫代氨基羧酸苄酯和0.1?0.15mmol四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯溶于1g的乙腈中，得到混合溶液，并所述混合溶液中通氮气20分钟；
取25?30g所述喹诺酮类抗生素衍生玻璃珠于平底杯中，往烧杯中通氮气20分钟； 将所述混合溶液倒入上述平底杯中，紫外照射I?3分钟，得到反应混合物；
将所述反应混合物转移至固相萃取管中，用6?8床的冷乙腈洗涤玻璃珠，得到半成品玻璃珠，通氮气1分钟；
取220?270 mg PEG4000溶于8 mL乙腈中，通氮气5分钟后，倒入上述半成品玻璃珠表面，摇动混匀，紫外照射I?3分钟，将所述反应混合物倒入至固相萃取管中，用6?8床的冷乙腈洗涤玻璃珠，然后用80?100 mL、60?70°C乙腈淋洗，得到喹诺酮类抗生素印迹的纳米分子印迹聚合物溶液，自然冷却至室温，用微孔超离心过滤器(30 kDa MWC0)离心分离得到喹诺酮类抗生素纳米分子印迹聚合物溶液。
[0007]本发明进一步提供了上述喹诺酮纳米分子印迹聚合物在检测喹诺酮抗生素方面的应用。
[0008]优选地，所述喹诺酮抗生素的检测包括以下步骤:
(1)酶标物辣根过氧化物酶-模板分子HRP-T的合成将20~30 mg喹诺酮抗生素溶于0.3 1^乙腈和2.0 mL、pH6.0的MES缓冲液中，再加入
0.2?0.4 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和0.3?0.6mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应15分钟后，立即与1mL含5?8 mg辣根过氧化物酶的pH 7.40的PBS缓冲溶液孵化2小时，然后用4.0 - 5.0 mL PBS缓冲液洗去未联接的抗生素，用微孔超离心过滤器(30 kDa MffCO)在转速3500 rpm下分离得到酶标物HRP-T溶液；
(2)标准曲线图制作
通过酶联免疫竞争吸附法测定不同浓度喹诺酮抗生素的吸光度，建立抗生素浓度-吸光度的标准曲线图；
(3)喹诺酮抗生素的检测
将预处理后的待检测物通过酶联免疫竞争吸附法测定喹诺酮抗生素的吸光度，根据该吸光度与标准曲线图比对，获取待检测物中喹诺酮抗生素的浓度；
在步骤(2)和(3)中，所述酶联免疫竞争吸附法具体为:将40 uL、浓度为0.04?0.06mg/mL喹诺酮纳米分子印迹聚合物溶液包被在微孔盘中；PBS溶液洗涤，然后加入300UL含质量浓度为1.5 °/c^Tween 20和质量浓度为0.15%的BSA的I3BS溶液;孵化卜1.5 h，PBS溶液洗涤，然后每个孔中加入100 HL的酶标物HRP-T溶液和喹诺酮抗生素待测液室温下孵化I h，用含Tween 20和BSA的I3BS溶液洗涤，加入60 -100 yLTMB试剂显色反应10分钟，加入60?101IL 0.5mol/L H2SO4溶液终止反应;酶标仪读取器读取450nm处每个微孔溶液的吸光度。
[0009]优选地，在步骤(2)之前，还包括酶联免疫竞争吸附法的条件优化步骤，所述酶联免疫竞争吸附法的条件优化步骤具体过程为: 包被:取30 -50 uL权利要求书(I)中浓度为0.04~0.0611^/1111的喹诺酮纳米分子印迹聚合物溶液至96孔酶标板中；在室温下挥发至干，用300UL PBS溶液洗涤；
封闭:加入含有200?300UL含质量浓度为1~3%的表面活性剂Tween 20和质量浓度为0.1-0.3%的牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，孵化I?2h;然后再用300?400ULPBS溶液洗涤；
加样:加入60?100 yL酶标物HRP-T溶液，孵化I?2h;
显色与测定:加入300?400 yL含有质量浓度为1~3%的Tween 20和质量浓度为0.1?
0.3%的BSA的PBS溶液洗涤，甩干，加入60?lOOyL HRP底物TMB试剂，孵化2?10分钟后加入H2SO4溶液终止显色反应，最后用酶标仪测定其在450nm处的吸光度，确定最优检测参数。
[0010]优选地，在步骤(3)中，所述待检测物为肉类，所述肉类包括鱼类、鸡肉；该肉类的预处理包括:鱼类样品去鳞、去皮，沿背脊取肌肉；鸡肉类样品去皮去骨，取肌肉部分。样品均质处理成肉糜状的待测试样。准确称取试样，置于聚苯乙烯离心管中，加入酸化乙腈，均质处理，漩涡混合，超声波提取，以4000r/分钟离心5?10分钟，上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到喹诺酮抗生素的PBS缓冲液。
[0011]优选地，在步骤(3)中，所述待检测物为牛奶，所述牛奶的预处理为:取牛奶进行离心分离，收集上层清液，上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到喹诺酮抗生素的PBS缓冲液。
[0012]优选地，在步骤(3)中，所述待检测物为水，所述水的预处理为:0.45um滤膜除去悬浮物，收集上层清液，上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到喹诺酮抗生素的PBS缓冲液。
[0013]优选地，所述喹诺酮抗生素包括恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星。
[0014]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明所采用的固相法合成抗生素印迹的纳米分子印迹聚合物可直接代替抗体，用仿生酶联免疫吸附法测定水中和食物(牛奶，鸡肉、猪肉、鱼肉、鸡蛋等)中的喹诺酮抗生素，不仅可以避免以上方法的缺陷，而且此方法样品的前处理简单，不需要进行分离，简单快速、检测特异性高，检出限低，其中，本发明纳米分子印迹聚合物对喹诺酮抗生素的检出极限达到0.003nM，准确率达到95%。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0016]实施例1喹诺酮类抗生素纳米分子印迹聚合物溶液的制备
取玻璃珠300 g，加入160 mL、2mol/L NaOH水溶液，加热沸腾10分钟，玻璃珠用水洗至洗液的PH= 9，烘干，即得羟基化玻璃珠。150 mL干甲苯加入至上述羟基化玻璃珠中，然后加入3 mL 3-胺丙基三甲氧基硅烷，剧烈摇动混合物，室温下放置过夜，过滤，丙酮冲洗，收集得硅烷化玻璃珠。
[0017]在20 mL乙腈和80 mL pH 6.0 PBS缓冲溶液中，加入80 mg喹诺酮类