玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物及其制备方法与应用

文档序号:9927593阅读:1219来源:国知局
玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于天然蛋白质化学改性及其医学应用领域,具体涉及一种玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物及其制备方法与其在肝细胞支架材料构建方面的应用。
【背景技术】
[0002]源于主要农作物的玉米醇溶蛋白,是一类量大面广、无毒且易生物降解的天然高分子,近年作为生物医用材料、特别是组织工程支架材料的改性和高值化利用研究,正逐渐引起国内外学者的极大关注。与组织工程支架构建常用的合成高分子原材料如聚乳酸、聚已内酯、聚碳酸酯、聚羟基乙酸等相比,这类天然高分子不仅具有原料丰富、可再生和良好的生物相容性,且其分子结构中还富含可供进一步化学修饰改性的氨基、羧基、羟基和巯基等反应性功能基团。早在2004年,采用溶液浇铸法制备的玉米醇溶蛋白多孔膜便被报道用作人体肝脏细胞(HL-7702)和鼠类纤维原细胞(NH3T3)支架;其后,采用盐沥滤法制备的玉米醇溶蛋白多孔支架亦被报道用作骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells)支架以修复骨组织缺损及用作牙周韧带细胞支架以修复牙组织缺损。然而,直接由玉米醇溶蛋白构建的支架材料,与种子细胞的相互作用较弱、粘附性较差,因而难以在医学临床中获得实际应用。
[0003]糖聚肽是近年新发展起来的一类新型仿生高分子,不仅无毒和具有优良的生物相容性、水溶性和可生物降解性,还特别具有能够模拟哺乳动物细胞膜表面糖蛋白的“多元效应”,因而一直被视为天然糖蛋白的理想仿生类似物。这类生物模拟高分子通常由含糖氨基酸环内酸酐大单体通过开环聚合而得,具有简便、高效、产率高等优点,且其分子量大小及其分布可控。其中,生物活性糖组分在细胞表面的生物学识别过程中发挥着重要作用,它既可为能够与多种组织(包括皮肤、肝、心肌等)细胞中跨膜表达的C型凝集素受体进行特异性识别的甘露糖,也可为能够与哺乳动物肝实质细胞表面高度表达的去唾液酸糖蛋白受体进行特异性识别的半乳糖;而聚肽组分则是由若干氨基酸经酰胺键(肽键)连接而成的大分子,在生物酶作用下可降解成在体内进行代谢和吸收的小分子氨基酸,具有很高的生物相容性和与天然蛋白大分子类似的化学结构。目前,糖聚肽仿生高分子已被用于制备具有生物活性的聚合物囊泡和聚合物胶束,但未见有研究工作将其用于改性玉米醇溶蛋白以构建组织工程用特异性细胞支架材料。

【发明内容】

[0004]为了克服现有技术的不足与缺点,本发明的首要目的在于提供一种玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物的制备方法。本发明首先利用玉米醇溶蛋白大分子固有的氨基引发含叠氮官能团的N-羧酸内酸酐单体开环聚合,得到由含叠氮侧基的多肽修饰的玉米醇溶蛋白,再利用叠氮与炔基间的点击化学反应,将半乳糖接枝到多肽链段侧基上,得到玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物,借助静电纺丝技术可将其制备出相应的电纺纤维膜用作肝细胞支架材料。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述制备方法制得的玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物。本发明制备的玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物,其主体材料为玉米醇溶蛋白,它具有很好的生物相容性和降解性,安全无毒,并且价格低廉。
[0006]同时,本发明制备的玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物,其聚肽组分由若干氨基酸经酰胺键(肽键)连接而成,具有与天然蛋白类似的化学结构,可望对所制得支架材料的力学、生物降解性能进行有效调控。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物的应用。本发明提供的玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物由于引入了大量的半乳糖侧基,因此可与肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性结合,使肝细胞在电纺膜材料表面很好的粘附生长。
[0008]此外,本发明采用静电纺丝技术进行加工成型,赋予材料纤维结构,使其具有比表面积大、孔隙率高的特点,因而作为细胞支架材料使用时更有利于细胞生长、养分传输和代谢物的排放。
[0009]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0010]一种玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物的制备方法,包括以下步骤:
[0011 ] (I )3-炔丁基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的制备:将10.00质量份半乳糖五乙酸酯和2.3体积份3-丁炔-1-醇溶于50?100体积份二氯甲烷(优选用干燥的二氯甲烷)中,在-10?4°C并于惰性气体保护下滴加4.8体积份三氟化硼乙醚(Et20.BF3),于室温下反应2h制得3-炔丁基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷;
[0012](2)3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷的制备:将10.00体积份3-炔丁基2,3,4,6-四-0-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷溶于50?150体积份无水甲醇中 ,加入I体积份甲醇钠的甲醇溶液;反应6?24h制得3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷;
[0013](3) 2-叠氮乙醇的制备:将10体积份2-氯乙醇、7.80质量份NaN3和0.40质量份NaOH溶于25?50体积份水中,于室温下搅拌反应48?72h制得2-叠氮乙醇;
[0014](4) γ-2-叠氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3)的制备:将20.00质量份L-谷氨酸分散于50?60体积份2-叠氮乙醇中,冷却至(TC,再缓慢滴加8体积份浓硫酸,于室温下搅拌反应过夜制得γ -2-叠氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3);
[0015](5) γ -2-叠氮乙基-L-谷氨酸酯N-羧酸内酸酐(CELG-N3-NCA)的制备:在惰性气体保护下,将5.00质量份CELG-N3分散于50?150体积份四氢呋喃(THF)(优选用干燥的四氢呋喃)中,加热至45?52°C,加入3.90质量份三聚光气,溶液立即变澄清;反应30min制得γ -2-叠氮乙基-L-谷氨酸酯nca(celg-n3-nca);
[0016](6)玉米醇溶蛋白与聚(γ-2-叠氮乙基-L-谷氨酸)接枝物(Zein-PCELG-N3)的合成:将0.50质量份CELG-N3-NCA溶解于1?30体积份N ,N’ -二甲基甲酰胺(DMF)(优选用干燥的DMF)中,于惰性气体保护下加入适量玉米醇溶蛋白(通过改变玉米醇溶蛋白的加入量对聚肽链段的接枝比例进行调控),于室温下搅拌反应24?96h制得Zein-PCELG-N3;
[0017](7)玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物(ZG)的合成:将0.02质量份Zein-PCELG-N3和
0.02质量份3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷溶于20?50体积份DMSO或DMF中,于惰性气体保护下加入0.06质量份五水硫酸铜,再通惰性气体10?20min后加入0.09质量份抗坏血酸钠,于40?60 °C下搅拌反应24?96h,透析72?96h,冻干得产物玉米醇溶蛋白与糖聚肽接枝物。
[0018]步骤(I)所述的半乳糖五乙酸酯可优选为通过以下步骤制备得到的半乳糖五乙酸酯:将5.0O质量份D-半乳糖溶于15?30体积份吡啶中,在O°C并于惰性气体保护下加入27体积份乙酸酐;反应12?36h后缓慢倒入70?150体积份冰水中,然后用有机溶剂萃取,将有机相用饱和NaHCO3溶液清洗至无气体产生,再依次用水、浓盐水清洗,干燥后旋蒸,得油状产物即为半乳糖五乙酸酯;
[0019]其中用于萃取的有机溶剂优选为乙酸乙酯,萃取次数优选为3?5次;所述依次用水、浓盐水清洗次数优选3?5次;所述干燥优选用无水硫酸镁干燥。
[0020]步骤(I)中反应完成后产物先用二氯甲烷稀释后分别用饱和NaHCO3溶液和水洗涤,然后干燥有机相,再旋蒸后柱层析分离,得黄色油状液体即为3-炔丁基2,3,4,6_四-0-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷;
[0021 ]步骤(I)中所述洗涤的次数优选为3?5次,所述干燥有机相优选用无水硫酸钠干燥有机相,所述柱层析分离用体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱,Rf = 0.28。
[0022]步骤(2)中反应完成后加入H+型离子交换树脂IR 120,搅拌过夜后过滤,减压蒸馏得淡黄色固体,使用正丙醇重结晶得3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷;
[0023 ] 步骤(2)所述甲醇钠的甲醇溶液中甲醇钠浓度为Imo 1/L。
[0024]步骤(3)中反应完成后用有机溶剂萃取,合并有机层,干燥后旋蒸得黄色液体即为2-叠氮乙醇;
[0025]步骤(3)所述有机溶剂优选为二氯甲烷,萃取次数优选为三次;所述干燥优选用无水硫酸钠干燥。
[0026]步骤(4)中反应完成后将反应液缓慢倒入200?500体积份三乙胺中,抽滤得沉淀并用甲醇洗涤,即得γ -2-叠氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3)。
[0027]步骤(5)中反应完成后冷却至室温,旋蒸除去溶剂,将棕色油状物溶于50?150体积份乙酸乙酯中,用饱和NaHCO3冰水溶液洗涤至无气体产生,再用冰水洗涤;干燥有机相后旋蒸得到棕色油状产物即为γ -2-叠氮乙基-L-谷氨酸酯nca(celg-n3-nca);
[0028]步骤(5)所述用冰水洗涤的次数优选为3次,所述干燥有机相优选用无水硫酸镁干燥。
[0029]步骤(6)中所述的玉米醇溶蛋白与γ-2-叠氮乙基-L-谷氨酸酯NCA的质量比优选为0.05?0.10:0.
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1