菌株及其应用，以及疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及菌株及其应用，W及疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 毛皮动物主要指产品为制裘原料的动物。随着经济的发展、人们生活水平的提高 和需求的不断增长，中国毛皮业呈现出强劲的发展趋势。我国毛皮动物养殖业主要集中在 山东、河北、迂宁和黑龙江等地，养殖的品种主要有水貂、骆、狐、懒兔，年产水貂皮600万张、 狐狸皮200万张，其中狐狸皮占世界总产量的35%，水貂皮占世界总产量的12%。经过多年 的发展和积累，毛皮动物养殖已成为一项优势产业，我国已成为世界上最大的毛皮产品生 产国和出口国，它的发展不仅为国家赚取了大量外汇，还直接带动了农业结构的调整，促进 了农民增收，局部地区甚至已成为区域经济的支柱性产业，对推动农"经济发展起到了 重要的作用。
[0003] 水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌引起水貂的一种急性传染病，多发生于秋季溫 暖潮湿，W咳嗽、呼吸困难、吐血、鼻出血为临床特症、W肺大面积出血、肺肝样变、肺水肿为 主要病变特征，发病率为20 %-50 %，死亡率为100%。病貂发病急，死亡快，常呈地方性暴发 性流行。近年来由于水貂养殖规模和集约化程度明显提高，水貂出血性肺炎的发病率显著 上升，该病危害程度逐年加深，已成为危害我国水貂养殖的主要传染病之一。
[0004] 鉴于该病的发病特点及该菌易产生耐药性问题，用药物治疗该病往往很困难，灭 活疫苗是预防该病的最有效方法，将水貂中流行的血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫 苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病，"水貂铜绿假单胞菌分离株的生物学特性比较 分析和血清型调查"（白雪，柴秀丽，国喜军，高哈，张海玲，赵建军，张蕾，邵西群，罗国良，王 长凤'水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法"（专利号：ZL201010203879.1，国喜 军、白雪、柴秀丽、罗国良、赵建军、张海玲、邵西群、张蕾、高哈，）公开了我国引起水貂出血 性肺炎的铜绿假单胞菌的主要血清型为G型和B型，并利用运巧巾血清型菌株化15(国家菌种 保藏号CGMCC NO. 3811)和化08(国家菌种保藏号CGMCC NO. 3812)研制出了可用于预防水貂 出血性肺炎的二价灭活疫苗，2011年该产品获得了农业部的临床试验批件，并同时进行了 临床推广应用。2016年获得了国家新兽药证书(=类）。
[0005] 水貂病毒性肠炎是水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis parvovirus ,MEV)引起的 W剧烈腹泻为主要临床特症的急性烈性、高度接触性传染病，其死亡率高达80% W上，该病 在世界范围内广泛流行，在自然条件下，不同品种和不同年龄的貂均有感染性，但幼貂的感 染性极强，随着特种养殖业的发展，病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖的=大疫病之一，给 养貂业带来巨大的经济损失，1947年由加拿大学者Schofield最早发现并报道了 MEV引起的 疾病。1981年姜廷秀等首先报道了我国发生水貂病毒性肠炎，此后该病逐渐蔓延全国，给养 貂业带来巨大的经济损失。我单位吴威等用单克隆抗体对我国分离的水貂肠炎细小病毒进 行系统分型，确定我国水貂肠炎细小病毒主要由B型细小病毒引起，在此基础上选育出毒力 稳定、免疫原性良好的病毒株MEVB株，并研制出水貂细小病毒灭活疫苗，2010年获得了国家 新兽药证书(=类），并迅速在市场上应用。使该病得到较好的控制。
[0006] 目前国内还未有水貂细小病毒性肠炎、水貂出血性肺炎的二联疫苗，市场上也无 该种二联苗使用。而使用单苗需要对水貂进行多次免疫，免疫剂量大，免疫程序繁琐，增加 了人力、物力和财力成本，同时还易引起水貂的应激反应。
[0007] 本项目在研究成功水貂细小病毒性肠炎和水貂出血性肺炎的基础上开发"一针防 两病"的水貂细小病毒性肠炎和出血性肺炎二联灭活疫苗，技术上攻克了联苗中的两种成 分细小病毒和铜绿假单胞菌的抗原成分互相干扰、疫苗含量配比及生产工艺的问题。本研 究在水貂出血性肺炎二价灭活疫苗研制的基础上，在疫苗株中新加入了近几年出现的流行 株I型、C型和F型，制备为水貂出血性肺炎五价灭活疫苗(G型、B型、I型、C型和F型），能够对 水貂出血性肺炎新的血清型菌株的流行起到很好的预防作用，可解决国内原有疫苗的对该 病只能提供部分保护的问题，更为有效预防水貂出血性肺炎的发生。
[0008] 通过对二联疫苗的研制及关键技术创新，研制出一种高效、副作用小、市场推广可 行的二联苗，解决了单苗免疫程序上的复杂问题，满足行业和养殖户的迫切需求，具有广阔 的市场应用前景。
[0009] 现有技术是用转瓶通气的培养技术将运两株铜绿假单胞菌用PYG培养基增菌培 养，37°C 18化/m摇床培养12h后收菌，用细菌平板计数法测定两株菌的菌量分别达到40X IO8CFlVml，将G型菌株和B型菌株按2:1的比例混合；（1)用终浓度为0.15%的甲醒溶液对铜 绿假单胞菌进行灭活，于37°C灭活2地，期间振摇2~3次；（2)将灭活后的菌液加20%比例的 氨氧化侣胶，混匀后即可得到水貂铜绿假单胞菌多价灭活疫苗。原有的培养基:PYG培养基 成份:蛋白腺2%，葡萄糖1 %，氯化钢0.5%，酵母粉0.3%，用去离子水配制，配完调pH值7.2 ~7.4,116°C 30min。但是使用转瓶通气培养菌体，接种比例为3%~4%，通气培养12~ 15h，由于疫苗的转瓶生产工艺落后，转瓶数目较多接菌时易于污染，培养时间长，生产菌数 少，在20~40亿CRJ/ml之间，只适用于疫苗研制前期的小批量生产。
[0010] 选用铜绿假单胞菌的当前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌Kl型3种菌株制 备成灭活疫苗。免疫了 WlO%灭活肺炎克雷伯困为佐剂的疫苗，保护率为83% ;免疫了 W 10%A1(0H)3佐剂的疫苗，保护率为71%;而作为空白对照组，仅注射了生理盐水的第6组小 鼠的存活率为33%。相对于传统的A1(0H)3佐剂，肺炎克雷伯菌本身可W作为疫苗成分，保 护机体免于该病原菌的感染，同时又兼有良好的免疫调节活性，加强了机体对铜绿假单胞 菌的免疫应答，产生了更高的抗体水平和提供了更好的免疫保护，兽医临床具有一定的应 用价值。
[0011] W上几种研制的水貂出血性肺炎中使用的疫苗株血清型主要包含2种或3种，即G 型，B型，或G型、C型、I型，根据本单位进行的水貂出血性肺炎流行病学调查，2010年至2015 年的流行血清型新出现了F型、I型和C型，而由于各种流行血清型之间的交叉保护率低，大 约为20%-30%。所W有必要加入所有可能的流行血清型。
【发明内容】
[0012] 有鉴于此，本发明提供了菌株及其应用，W及疫苗及其制备方法。该疫苗免疫期为 6个月，免疫保护率80% W上，可同时用于预防水貂细小病毒性肠炎和水貂出血性肺炎的， 减少了养殖户的免疫工作量和水貂应激反应，市场应用前景较好。
[0013] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0014] 本发明提供了 一种铜绿假单胞菌株，其保藏编号为CGMCC No. 11988。
[0015] 本发明还提供了一种铜绿假单胞菌株，其保藏编号为CGMCC No. 11990。
[0016] 本发明还提供了一种铜绿假单胞菌株，其保藏编号为CGMCC No. 11989。
[0017] 本发明还提供了保藏编号为CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的铜绿假单胞菌株在制备水貂出血性肺炎疫苗中的应用。
[001 引本发明还提供了保藏编号为CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的铜绿假单胞菌株在制备水貂细小病毒性肠炎、出血性肺炎二联灭活疫苗中的应用。
[0019]本发明提供了一种水貂出血性肺炎疫苗，由本发明保藏编号为CGMCC No. 11988、 CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的铜绿假单胞菌株W及水貂铜绿假单胞菌G型化15株、B 型化08株制得。
[0020] 本发明还提供了一种水貂细小病毒性肠炎、出血性肺炎的二联灭活疫苗，由本发 明保藏编号为CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的铜绿假单胞菌株W及 水貂铜绿假单胞菌G型化15株、B型化08株和水貂细小病毒毒株MEVB株制得。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，二联灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
[0022] 步骤 1:取本发明保藏编号为CGMCC No.11988、CGMCC No.11990和CGMCC No.11989 的铜绿假单胞菌株W及水貂铜绿假单胞菌G型DL15株、B型化08株分别接种于培养基培养后 混合、灭活后制得灭活后铜绿假单胞菌五价苗半成品菌液；
[0023] 步骤2:取水貂细小病毒毒株MEVB株接种细胞，收获、灭活制得细小病毒半成品；
[0024] 步骤3:取步骤1制得的灭活后铜绿假单胞菌五价苗半成品菌液与步骤2制得的细 小病毒半成品混合制得混合液；
[0025] 步骤4:取步骤3制得的混合液与佐剂混合。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，