可降解吡啶和氨氮的菌株、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境生物技术领域，具体设及一株可高效降解化晚和氨氮的菌株、制 备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 化晚作为工业溶剂和多种化合物合成的基础化工原料，应用于农药、医药、染料、 日用化工、香料、饲料添加剂、橡胶助剂等领域。化晚是典型的含氮杂环化合物，易溶于水， 容易扩散进入环境，且难W生物降解，严重威胁人类的健康，属于"立致"类环境污染物。
[0003] 与传统物理化学处理法相比，生物修复具有高效、投入资金少、运营成本低、且较 少产生二次污染，生态可承受等优点，能够高效治理大面积的污染，大量的微生物对环境可 W起到一定的修复作用，通过生物修复，可W使受污染生态系统恢复正常的生态功能及效 应，其在环境污染治理中占有极其重要的地位。目前已从环境中筛选出一些对化晚具有一 定的降解能力的细菌，但大多耐受及降解化晚的能力较低。
[0004] 化晚降解菌在降解化晚的过程中会产生代谢产物氨，氨的积累会对化晚降降解产 生反馈抑制，从而显著降低该菌的化晚降解能力，运也是目前所筛选的化晚降解菌降解能 力不强的重要原因之一。而且氨氮本身就是一种广泛存在于工农业及生活废水中的环境污 染物，若扩散进入环境会造成极大的危害，是引起水体富营养化的主要成因之一，同时废水 中存在的高浓度氨氮会显著抑制微生物的生长及代谢，也对化晚及其他污染物的生物降解 及环境的生物修复带来显著的负面影响，而目前筛选和应用于氨氮废水处理的氨氮降解 菌大多降解能力较弱，不能在短时间内快速降低废水中的氨氮浓度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种针对目前化晚降解菌降解能力较低，对氨氮的耐受力 不强的状况，能降解高浓度化晚且耐受氨氮的菌株，该菌株可用于含高浓度化晚废水的生 物强化处理。
[0006] 另一个目的是针对部分类型废水中氨氮浓度较高的特点，检测所筛选菌株耐受及 降解高浓度氨氮的能力，并将其应用于高浓度氨氮废水处理。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供的可高效降解化晚和氨氮的菌株，它于2014年4月25 日在中国典型培养物保藏中屯、CCTCC保藏，保藏编号CCTCC M 2014165,该菌株属于节杆菌 属（A;rth;robacter sp.)，命名为Arthrobacter ureafaciens CZ3,保藏地址为：中国武汉， 武汉大学。
[000引上述可高效降解化晚和氨氮的菌株的制备方法，包括W下步骤：
[0009] (1)、从焦化废水生化处理车间曝气池和二沉池中取样，将污泥置于=角瓶中，放 置玻璃珠，于 150- 200rpm，30°C - 33°C，震荡25- 35min，每3000g离屯、10-12min，收集沉淀，将 污泥沉淀接种至LB培养基，加入浓度300mg/L的化晚；
[0010] (2)、定向驯化和初筛：至步骤（1)中化晚降解完，按体积分数5%转接于浓度为 500mg/L的MSP液体培养基中，该培养基W化晚作为唯一碳、氮源和能源，如此反复，继续增 加化晚浓度，依次增加至800mg/L，lOOOmg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/l;将驯化后的菌 液按l(T 2-l(r7不同稀释比例铺MSP固体平板，挑单菌落，在LB固体平板划线纯化S次，将纯 化后的单菌落分别保种；
[0011] (3)、复筛:将步骤(2)中初步筛选的化晚降解菌接种至MSP培养基中，该培养基W 浓度为2000mg/L的化晚作为唯一碳源和能源，HPLC检测不同细菌的化晚降解率，筛选化晚 降解菌，筛选在30-32小时内完全降解2000mg/L化晚的菌株。
[0012] 上述的可降解化晚和氨氮的菌株应用于含化晚废水的处理。
[0013] 进一步地，上述可降解化晚和氨氮的菌株，应用于化晚浓度低于3000mg/L的废水 处理。
[0014] 上述的可降解化晚和氨氮的菌株应用于浓度高于4000mg/L的高浓度氨氮(NH4+-N) 废水生物处理中。
[0015] 本发明的有益效果在于，针对高浓度化晚对细菌生长会产生显著抑制，对化晚降 解菌进行初步驯化和筛选后，采用高浓度化晚作为唯一碳、氮源和能源进一步筛选化晚降 解菌，获得了 一株能W化晚作为唯一碳、氮源和能源生长的高效化晚降解菌Arthrobacter ureafaciens CZ3。将菌株CZ3应用于含化晚废水的实验结果表明，该菌具有高效降解高浓 度化晚的能力，菌株CZ3在32小时内即可完全降解2329mg/L化晚，与其他化晚降解菌相比， 具有较强的化晚降解能力，可应用于含高浓度化晚废水的生物强化处理。
[0016] 本发明还进一步将CZ3应用于含高浓度氨氮废水的处理中，在2617mg/L的高氨氮 初始浓度的模拟废水中，CZ3的氨氮去除速率可达104.1mg-N/l/h，具有较强的氨氮快速去 除能力和很高的氨氮耐受力。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明所述菌株CZ3菌落形态(图IA为LB培养基;图IB为MSP培养基）；
[0018] 图2为本发明所述菌株CZ3不同培养时期扫描电镜图(A.她，B.12h，C.16h，D.26h);
[0019] 图3为本发明所述不同初始化晚浓度对化晚降解的影响；
[0020] 图4为本发明所述不同初始化晚浓度对菌株生长的影响；
[0021] 图5为本发明所述不同初始氨氮浓度对氨氮降解速率的影响；
[0022] 图6为本发明所述不同初始氨氮浓度对氨氮降解率的影响；
[0023] 图7为本发明所述菌株的16s rRNA序列图。
【具体实施方式】
[0024] 为便于更好的理解本发明的目的、特征W及有益效果等，现结合附图和具体实施 例对本发明作进一步的详细描述。
[0025] 实施例1化晚降解菌的筛选和鉴定
[0026] (1)化晚降解菌驯化和筛选
[0027] 本实施例中的菌株CZ3是从武汉钢铁公司焦化废水生化处理车间曝气池和二沉池 中取样，经过富集、初筛和复筛得到的。
[00%]实施例中的LB液体培养基组成:酵母提取物5g/L，膜蛋白腺lOg/L，化Cl lOg/LcLB 固体培养基为LB液体培养基中加入1.8 %琼脂。
[0029] MSP无机盐培养基组成如下：Na2HP〇4 6.78g/L，K出P〇4 3.0g/L，化Cl 0.5g/L， MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，CaCl2 O.Ollg/L，化晚500-3000mg/L，微量元素2ml/L。微量元素组成： MnS〇4 ?此0 1.69g/L，CoCl2*6H2〇 0.24g/L，曲B03 1.16g/L，化2Mo〇4*2出0 0.024g/L， FeS04.7H20 2.78g/L，ZnS04?7H20 1.15g/L，CuS〇4?5H2〇 O.SSg/LsMSP固体培养基含 1.8%琼脂。
[0030] ①富集:将3克污泥置S角瓶(放置玻璃珠)于18化pm，30°C，震荡30min，3000g离 屯、lOmin，收集沉淀，将Ig污泥沉淀接种至LB(加入化晚，浓度300mg/L)培养基；
[0031] ②定向驯化和初筛：至①中化晚降解完，按体积分数5%转接于W化晚作为唯一 碳、氮源和能源，浓度为500mg/L的MSP液体培养基中，如此反复，继续增加化晚浓度，依次增 加至 800mg/L，1 OOOmg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/l;将驯化后的菌液按 10 ―2 -10 ―7不同 稀释比例铺MSP固体平板，挑单菌落，在LB固体平板划线纯化S次，将纯化后的单菌落分别 保种。
[0032] ③复筛:将②中初步筛选的化晚降解菌接种至化晚(浓度约2000mg/L)作为唯一碳 源和能源的MSP培养基中，HPLC检测不同细菌的化晚降解率，筛选化晚降解菌，筛选到一株 可W在32小时左右可W完全降解2000mg/L化晚的菌株，初步命名为CZ3,用于后续研究。
[0033] (2)菌株鉴定
[0034] 从形态学、生理生化及分子遗传学=方面对CZ3进行菌株鉴定
[0035] ①菌株CZ3菌落形态观察:将菌株CZ-3挑单菌落分别于营养琼脂平板和MSP固体平 板划线，置生化培养箱30°C培养，24-48h后观察该菌在不同培养基中的菌落形态，见图1。在 营养琼脂平板上，菌落呈现乳白色，圆形，表面光滑，边缘整齐，易挑起，置4 °C放置后菌落呈 现非扩散性的巧樣黄;在MSP基础无机盐平板上的菌落相对较小，半透明且无色素生成，表 面平滑，易挑起，边缘隆起。该菌呈现革兰氏染色阳性的特征，在LB固体培养基中培养至对 数期时形态为杆状或镶刀形等不规则形态，在MSP基础无机盐固体培养基中为球状，说明菌 株杆球状的形态变化与培养的环境条件有关，尤其是培养基的营养条件。该菌株无鞭毛，无 芽抱生成。
[0036] 通过扫描电镜(SEM)进一步了解菌株外部形态特征，制备好的样品表面喷金后用 扫描电镜观察细菌外部形态。扫描电镜观察菌株外部形态特征是菌种鉴定的常用方法之 一，将菌株CZ3接种至完全培养基中3(TC培养，在不同时期取样，制备样品后采用场发射扫 描电镜观察。观察结果(如图2所示)发现，完全培养基中，细菌在不同的培养时期呈现不同 的形态，是一种变形菌，在培养初期，菌株CZ3为形态不规则的长杆状，包括直、弯曲、棒状、V 字形等多种形态;对数生长期时，其长度逐步缩短，菌体形态变成短杆状;至稳定期和衰亡 期，杆状细胞逐步为球状细胞所取代。杆状细胞的大小0.4-0.5 X 1-6皿，球状细胞的直径约 0.5-0.9 皿。
[0037] ②生理生化分析：菌株CZ3的生理生化