一种水稻雄配子体高度特异表达启动子OsPoll1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明设及一种水稻 雄配子体高度特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在 雄配子体中高度特异表达，从而达到研究水稻雄性不育分子机理的目的。
【背景技术】
[0002] 杂种优势的利用是提高作物产量和改良作物品种的重要途径之一。=系及两系杂 交稻的成功正是雄性不育系的实际应用。在植物基因工程创建雄性不育过程中，造成植物 花器官败育是必然途径，花粉(花药)特异性表达启动子与育性的研究密切相关。目前已在 不同物种中发现了多种花粉特异性启动子，其特异型表达机理也得到初步分析。如在烟草 中发现的花药绒拉层特异表达基因启动子TA29,呈现严格的花药专一'性。Mariani等将启动 子TA29分别与核酸酶Bamase和化aseTl基因融合后转化植物，运两种核酸酶基因在花药中 特异表达，破坏绒拉层，获得雄性不育烟草和油菜，开创了基因工程创造雄性不育系的先 河，至今已在烟草、油菜等植物上获得成功。但是，运种来自于双子叶植物的启动子大都难 W在单子叶农作物中表达，因此，要获得广泛应用于作物生产实践的基因工程雄性不育系 材料，必须从单子叶植物中发掘和利用新的启动子。
[0003] 水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，也是良好的单子叶植物模式生 物。但是，当前广泛使用的水稻启动子中，大部分都是组成型启动子，其在多数或全部组织 中保持持续的活性，运会增加植物的代谢负担，影响植株发育。
[0004] 因此从水稻中发掘花粉(花药)特异启动子，从分子水平上掲示花粉发育的机理特 别是花药花粉基因特异表达调控至关重要。但是，目前所报道的花粉特异启动子还很少，难 W满足研发和生产的需要。尤其是在雄配子体中特异表达的启动子，更是从未见过有相关 报道。
[0005] 因此，本发明希望提供一种雄配子体高度特异表达启动子，为雄性不育植物基因 工程和杂交水稻研究提供可用的遗传资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻雄配子体高度特异表达的启动子， 获得含有该启动子序列的宿主菌、转化子W及该启动子的应用。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻雄配子体高度特异表达启动子， 所述水稻雄配子体高度特异表达启动子包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一： [000引（a)SEQ ID N0:1中所示的核巧酸序列；
[0009] (b)SEQ ID NO:2中所示的核巧酸序列；
[0010] (C)在SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列中添加一个或多个核巧酸后所获得的核 巧酸序列；
[0011] (d)在SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列中添加一个或多个核巧酸后所获得的核 巧酸序列；
[0012] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸序列；
[0013] (f)与SEQ ID NO:2中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸序列；
[0014] (g)在SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列中取代一个或多个核巧酸后所获得的核 巧酸序列；
[0015] 化)在SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列中取代一个或多个核巧酸后所获得的核 巧酸序列；
[0016] (i)SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列缺失一个或多个核巧酸后所获得的核巧酸 序列；
[0017] (j)SEQ ID NO: 2中所示的核巧酸序列缺失一个或多个核巧酸后所获得的核巧酸 序列；
[0018] 化)与带有SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核巧酸序列；
[0019] (1)与带有SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核巧酸序列。
[0020] 上面(C)-(I)中所列的水稻雄配子体高度特异表达启动子序列与SEQ ID No: 1和2 所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在雄配子体中表达。
[0021] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（0巧za sativa L cv.Ni卵onbare)的序列，本文中称为Os化111或启动子Os化111。具体而言，本申请的发明人 发现日本晴水稻(Oirza sativa L CV.化卵onbare)中一段长度为1848bp的DNA序列具有驱 动目标基因在水稻雄配子体高度特异表达的作用。并且分离克隆得到了该DNA序列。
[0022] 需要说明的是:序列表中沈Q ID No: 1与沈Q ID No:2的主要区别在于沈Q ID No: l比沈QIDNo:2的序列开头多出了22个bp"agaagaggacacatt1:a1:acgc"，其为获得启动子 过程中使用的正向引物的留存序列，序列末尾也多出了22个bp"agacattcac caggaaacca Ct"，其为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序 列互补）；序列表中SEQ ID No:2中的DNA序列为纯获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调 的是，本文中所提到的启动子既可W指SEQ ID No: 1中的DNA序列，也可W指SEQ ID No:2中 的DNA序列。换言之，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序 列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0023] 优选地，本发明提供的水稻雄配子体高度特异表达启动子的DNA序列由SEQ ID No: 1或2所示的序列，即OsPol 11或启动子Os化111构成。
[0024] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻雄配子体高度特异表达启动子的表达 盒。
[0025] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 雄配子体高度特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻雄配子体高度特异表达 启动子连接于待表达的基因序列的上游;优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组 表达载体为pCAMBIA1391-〇sPolll，该重组表达载体为将本发明的启动子即Os化111或启动 子Os化111构建于PCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sPolll。
[0026] 或者待表达基因可W为任何对作物的雄配子体性状具有改善能力的基因。通过本 发明的启动子驱动该基因在雄配子体中特异性地集中表达，从而实现改善水稻雄配子体相 应性状的功能。
[0027] 另一方面，本发明还可W利用所述启动子获得相应宿主菌，即本发明提供一种利 用所述启动子获得宿主菌的方法。所述宿主菌包含本发明提供的上述水稻雄配子体高度特 异表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体;优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0028] 另一方面，本发明还可W利用所述启动子获得相应转化子，即本发明提供一种利 用所述启动子获得转化子的方法。所述转化子包含本发明提供的上述水稻雄配子体高度特 异表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转 基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0029] 再一方面，本发明提供上述水稻雄配子体高度特异表达启动子在培育转基因作物 中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻雄配子体高度特异表达启动子连接于载 体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前），从而构建 重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。
[0030] 所述应用具体包括：
[0031] A)、W水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述水稻雄配子 体高度特异表达启动子Os化111;