刺参itgb基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参itgb基因工程菌构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学W及基因工程领域，尤其是设及一种刺参口GB基因、编码 蛋白及其克隆方法和重组刺参ITGB基因工程菌构建方法。
【背景技术】
[0002] e-整合素(e-Integrin，ITGB)为亲异性细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞间的 相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。几乎存在于动植物细胞中。功能研究掲示脊 椎动物的整合素发挥着维持机体完整性的功能，并在细胞识别、信号传导和传递，细胞增 殖、分化、成熟、运动、游走的调控，W及炎症、创伤修复、肿瘤转移等生理和病理过程中发挥 重要作用。目前，对无脊椎动物整合素（Integrin)的研究主要集中在Integrin在机体早期 发育过程的作用，有关无脊椎动物Integrin参与机体免疫的研究较少。已有的相关研究主 要多集中在Integrin的0-亚基（ITGB)参与的免疫防御反应。Integrin对无脊椎动物的细菌 性疾病有关，Integrin可能通过与细菌上带有RGD结构域的配体结合，实现机体免疫细胞对 细菌的吞隧和包囊作用，运在某种海洋无脊椎动物中已经被验证。例如虐蚊的Integrin具 有吞隧大肠杆菌的功能(Ying et al.，2012)，此外，在牡颇Integrin的研究中，病原相关 分子模式(PAMPs)结合分析表明Integrin重组蛋白对脂多糖化PS)有一定的结合活性，对肤 聚糖(PGN)、甘露聚糖(Mannan)结合活性却明显偏低。通过与之前牡颇的PAMPs结合实验对 比，我们发现在相同浓度Integrin与3种内毒素解育的条件下，刺参整合素(AjITGB)对LPS 的结合活性是牡颇结合活性的2倍，显示了更强的LPS结合活性，而刺参整合素对PGN， Mannan的结合活性也很低，表明了其也有对内毒素结合上的特异性。刺参整合素在PAMPs结 合上的优越性，在刺参病害的防治中更能发挥重要的作用。
[0003] 刺参（Apostichopus japanicus)，是属于棘皮动物口（Echinodermata)、海参纲 (化Iothuridea)、循手目（AspidocMro化）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、 无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康持续 发展。目前对刺参病害的解决办法主要是发病W后的救治，而无法做到病前的预防和发现， 此类做法的结果往往会对刺参养殖业造成很大的损失，因此，筛选特异性好，结合活性强 的革兰氏阴性菌结合分子是在必行，同时，通过构建水产动物整合素基因表达工程菌，从而 产生工业化、高产量的刺参整合素，通过向患病刺参的生活环境中添加目的蛋白，在刺参自 身产生整合素的基础上增加了整合素对阴性致病菌的结合能力，从而提升刺参机体的免疫 力，可W为刺参的发病提供一种解决手段。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参口GB基因、编码蛋白及其克隆方法和 重组刺参口 GB基因工程菌构建方法，表达的重组刺参0-整合素蛋白对脂多糖具有更强的结 合活性，对肤聚糖、甘露聚糖结合活性较低。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种刺参口GB基因，该基因具有SEQIDN0.1所示的cDNA序列。
[0006] 2、上述刺参口 GB基因的克隆方法，根据与口 GB基因同源的表达序列标签EST序列 设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下： (1) 通过对灿烂弧菌诱导刺参血细胞CDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码 ITGB基因的表达序列标签序列，选取编码刺参ITGB部分片段的表达序列标签克隆； (2) RACE引物设计:根据编码刺参口 GB部分片段的表达序列标签克隆设计RACE的巢式 引物：3 '上游特异性引物1 : GG T TCAT TG T CAAAT CGG AG，3 '上游特异性引物2 : GATTACGTCGCTCTGGTCCA，5 ' 下游特异性引物 1: CCAACAATTCTGCAACCTCCG， 5 '下游特异性引物2 : TGCAACAAGGGGCACTTGGAG，扩增3 '接头引物Adaptors : TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT，扩增5 ' 接头引物Adapto巧：CATGGCTACATGCTGACAGCCTA ; (3) RACE扩增获取口 GB基因全长序列，具体步骤如下： a. 总RNA提取:参照上面刺参体腔液收集体腔细胞的方法制备RNA提取液； b. 3'-RACE扩增：将RNA提取液用3'-Full RACE Core Set with PrimeScript? R化Se试剂盒逆转录合成扩增3'的模板，W此为模板，使用3'上游特异性引物I和扩增3'接 头引物进行PCR扩增，取PCR稀释后的产物1 Ul作为模板，再用3'上游特异性引物2和扩增 3 '接头引物进行PCR扩增得到3 '端目的条带； C. 5 ' -RACE扩增:将上述RNA提取液用5 ' -Ful 1 RACE Kit试剂盒逆转录合成扩增5 '的模 板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，W此为模板，使用5'下游特异性引物1和Adapto巧 进行PCR扩增，取PCR产物稀释后1 Ul作为模板，再用5'下游特异性引物2和Adapto巧进行 PCR得到5'端目的条带； d.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体PMD18-T连接， 转化至大肠杆菌Escherichia COli D册a后，在含有氨节浓度为50 yg/mL的LB(膜蛋白腺 10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L)平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进 行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得刺参 ITGB基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 上述RACE扩增反应体系：模板1.0化，10 XPCR缓冲液2.5化，浓度25 mM的MgCl2 2.0化，浓度10 ml的dNTP 2.0化，浓度10測的特异性引物1.0化，浓度10咖的接头引物 1.0化，浓度抓/化的0麻聚合酶0.2化，超纯水：15.3化;扩增条件:94 1：3 111111、94 1： 30 s、60 °C 30 s、72 °C 1 min,共35个循环，最后72 °C延伸 10 min。
[000引3、上述刺参ITGB基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。 [0009] 4、利用上述刺参口 GB基因编码蛋白构建重组刺参口 GB基因工程菌的方法，步骤如 下：（1)设计PCR引物，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参口GB蛋白编码序 列；（2)将克隆得到的目的基因插入祀T28a(+)载体，获得重组质粒祀T28a(+)-ITGB; (3)对 重组质粒祀T28a(+)-ITGB进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌。
[0010] 具体步骤如下： (1) 口 GB基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达 a. 总RNA提取:取刺参体腔液制备得到RNA提取液； b. CDNA合成:将上述RNA提取液用CDNA合成试剂盒逆转录合成CDNA，然后W合成的CDNA 为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参口GB编码蛋白，其基因序列如 SEQIDN0.2所示，其中 含BmH I位点口GB上游扩增引物:GGATCCATGGCTGTGAGAACCCAGTT ； 含Not I位点口GB下游扩增引物:GCGGCCGCTCATGTCATGCTGTCAACTAATG ； c. PCR扩增：cDNA1.0化，10XPCR缓冲液2.5化，浓度25mM的MgCl2 2.0化，浓度10 mM的dNTP 2.0化，浓度10咖的上游引物1.0化，浓度10咖的下游引物1.0化，浓度抓Ai L的DNA聚合酶0.2化，超纯水：15.3化；扩增条件:94 °C 3 min、94 °C 30 S、60 °C 30 s、72 °C I min,共35个循环，最后72 °C延伸10 min ; d. PC郎日性克隆质粒:扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体 PMD18-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia COli D册a后，在含有氨节浓度为50 ug/mL的 LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR 阳性克隆质粒； e. 重组质粒:将PCR阳性克隆质粒用B恤巧日Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电 泳回收分子量在30KDa的目的条带，与经同样酶切的pET28a( + )原核表达载体酶切产物连 接，转化Escherichia COli D册a,PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载 体祀T28a(+)-ITGB重组质粒； f. 重组蛋白的表达:将阳性重组质粒祀T28a(+)-ITGB转化到表达宿主化21(肥3)，再接 种到卡那霉素浓度为50 ug/mL的LB培养液中，37 °C、200r/min振荡培养至菌液ODs日日的值为 0.4-0.6时，加入异丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧使其终浓度为1 mmol/L，37 °C诱导表达3-6 h，收集菌液，经1200化/min离屯、5 min,弃上清液，获得细菌沉淀物； (2)重组蛋白