基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗 乙肝表面抗原抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织统计，全球有20亿人感染过乙肝病毒。每年有近100万人死于乙肝 病毒慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。乙肝表面抗原化BsAg)定量检测是评价慢乙肝 治疗效果的重要手段。中华医学会发布的2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》指出：对血清 中的乙肝表面抗原进行定量监测，可用于预测疾病进展、抗病毒疗效和预后，停药后获得持 久的皿SAg消失为慢乙肝治疗的理想终点。
[0003] 目前用于乙肝表面抗原定量检测方法，均W抗原-抗体识别为基础。抗乙肝表面抗 原抗体(anti-HBsAg)在酶标板上分散均匀度和抗体的稳定性，直接影响乙肝表面抗原的定 量。然而目前市面上尚没有评估抗乙肝表面抗原抗体的方法，给乙肝表面抗原的定量检测 带来不确定性。
[0004] 传统方法多采用了绿色巧光蛋白融合表达的方法，即在目的蛋白质的碳端或者氮 端连接绿色巧光蛋白实现标记。然而，绿色巧光蛋白体积太大，会待标记的目的蛋白质的正 确折叠产生影响。
[0005] 因此，设计一种体积小相对较小的绿色巧光蛋白发光结构域(GFP-F-Domain)标记 的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，W保证乙肝表面抗原定量检测的准确性，是本领域亟 待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗 原抗体的制备方法，旨在保证乙肝表面抗原定量检测的准确性。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表 面抗原抗体的制备方法。所述基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的 制备方法包括如下步骤：
[000引 Sl:合成融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；
[0009] S2: W所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二DNA序列；
[0010] S3:将所述第二DNA序列连接至表达载体祀T2化质粒，获得第一目的克隆组；
[0011] S4:将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；
[0012] S5:破碎所述经过诱导表达的第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色巧光蛋白发光 结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。
[0013] 优选地，所述步骤S3包括如下步骤：
[0014] S31:纯化第二DNA序列，获得第；0臟序列；
[001引 S32:利刷良制性内切酶处理所述第立0酷序列，获得第四DNA序列；
[0016] S33:利用限制性内切酶处理表达载体pET2化质粒，获得线性化的祀T22b质粒，即 第五DNA序列；
[0017] S34:连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，获得第一连接产物；
[0018] S35:将第一预设量的所述第一连接产物和第二预设量的化21菌株感受态细胞混 合，转化并筛选培养，获得阳性克隆组；
[0019] S36:筛选所述阳性克隆组，进行测序验证，获得第一目的克隆组。
[0020] 优选地，所述步骤S5包括如下步骤：
[0021 ] S51:超声破碎所述第一细菌群，获得上清液；
[0022] S52:利用儀离子亲和柱纯化所述上清液，获得洗脱液；
[0023] S53:利用蛋白冻干的方法处理所述洗脱液，获得绿色巧光蛋白发光结构域标记的 抗乙肝表面抗原抗体。
[0024] 优选地，所述步骤S2中扩增所述第一 DNA序列的引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-F 的DNA序列为atgccaacacttgtcactac，引物GFP-F-Domain-anti-皿sAg-R的DNA序列为 cttgacttcagcacggtco
[00巧]优选地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列包括位于所述融 合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的5'端的编码绿色巧光蛋白GFP发光结构域的DNA序列、 位于3 '端的编码anti-冊sAg蛋白的DNA序列，W及位于5 '端和3 '端之间的连接肤DNA序列。
[0026] 优选地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一 DNA序列为单链DNA序列。
[0027] 优选地，所述限制性内切酶为Nde巧日趾Ol。
[00巧]优选地，所述第一预设量为20化，所述第二预设量为10化L。
[0029] 优选地，连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列时的溫度为16°C。
[0030] 本发明提供的基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备 方法，将编码绿色巧光蛋白GFP发光结构域的DNA序列与编码anti-皿sAg蛋白的DNA序列融 合在一起;利用GFP的巧光基团标记anti-皿SAg蛋白，根据检测到的巧光强度，即可换算出 anti-皿SAg蛋白的含量。本发明所采用的绿色巧光蛋白发光结构域由58个氨基酸组成，与 组成GFP的238氨基酸相比，分子量变为原来的四分之一。本发明采用体积小相对较小的绿 色巧光蛋白发光结构域(GFP-F-Domain)标记抗乙肝表面抗原抗体，提高了乙肝表面抗原定 量检测的准确性。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方 法的流程示意图；
[0032] 图2为本发明较佳实施例中步骤S3的细化流程示意图；
[0033] 图3为本发明较佳实施例中步骤S5的细化流程示意图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，W下实施例是对本发明的解 释，本发明并不局限于W下实施例。
[0035] 在本发明实施例中，乙肝表面抗原的英文缩写为皿sAg，是乙肝病毒基因编码的分 泌蛋白；抗乙肝表面抗原抗体的英文缩写为anti-HBsAg，是特异识别乙肝表面抗原的抗体； GFP即绿色巧光蛋白（Green Fluorescent Protein) ;dNTPs为脱氧核糖核巧S憐酸;pET22b 质粒为一种常用于基因工程的质粒，为目的基因的表达载体;BL21菌株，是一种常用的具有 蛋白质表达功能的大肠杆菌菌株。
[0036] 参照图1，图1为本发明基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法的流程示意图。所述基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法包括如下步骤：
[0037] Sl:合成融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；
[003引具体地，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列包括位于所述融 合基因6。口斗-00111曰111-曰11*1-册3結的5'端的编码绿色巧光蛋白6。口发光结构域6。口斗-Domain的DNA序列、位于3 '端的编码anti-冊sAg蛋白的DNA序列，W及位于5 '端和3 '端之间 的连接肤DNA序列。所述GFP-F-Domain DNA序列如核巧酸序列表所示;所述GFP-F-Domain蛋 白质序列如氨基酸序列表所示。
[0039] S2: W所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二DNA序列；
[0040] 具体地，在步骤Sl中，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-皿sAg的第一 DNA序列为 单链DNA序列。W该第一DNA序列为模板，利用聚合酶链式反应（PCR)，扩增所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg。所述PCR的扩增体系为50化，包括:无菌水40化、10倍浓度的缓 冲液化L、质粒DNA模板化L，PCR扩增时所需引物的名称为GFP-F-Domain-anti-皿sAg-F和 GFP-F-Domain-anti-皿sAg-R，所需引物的体积为各化L，IOmM dNTPs化L，高保真酶化L。本 发明中各步骤PCR反应体系均按照该体系进行。所述扩增体系，在PCR扩增仪上进行扩增， PCR反应扩增的方法为:94°C，4分钟，预变性;94°C，1分钟，变性;58°C，30秒，退火;72°C，3分 钟，延伸;重复变性-退火-延伸步骤26次后，72°C保溫5分钟，然后降溫到16°C，完成反应后， 获得第二DNA序列。该第二DNA序列为双链DNA。本实施例中，所述PCR扩增所需引物序列如表 1所示。
[0041 ] 表1PCR扩增所需引物序列 「rwvn1
L0043J S3:将所还第二DNA序列连援全表达载体祀T2化妨粒，获得第一目的克隆組；
[0044] 祀T2化质粒购自Novagen公司，是常见的用于基因克隆和蛋白质表达的质粒。在基 因工程实验中，pET22b质粒是大肠杆菌常用的表达载体，该质粒上带有Ampicillin(氨节青 霉素)抗性基因，是T7启动子系列中的一员，该质粒的复制子是化i，该质粒大小是5500bp， 标签是N-pelB信号肤，C-His，可转化进大肠杆菌中大量复制(37°C，LB)。本步骤采用基因工 程手段完成。
[0045] 具体地，参照图2,图2为本发明较佳实施例中步骤S3的细化流程示意图。所述步骤 S3包括如下步骤：
[0046] S31:纯化第二DNA序列，获得第SDNA序列；
[0047]具体地，可利用北京天根公司生产的商品化PCR纯化试剂盒，纯化所述第二DNA序 列，除去其中的盐分及引物二聚体，获得第SDNA序列；
[004引S32:利用限制性内切酶处理所述第SDNA序列，获得第四DNA序列；
[0049] 具体地，利用化kara公司生产的限制性内切酶Nde巧日趾OI处理第SDNA序列；第S DNA序列酶切的反应体系为50化，包括:第SDNA序列39化，Nde巧日趾Ol各化L，10倍浓度缓冲 液化L反应条件为37°C水浴解育4小时；再利用北京天根公司生产的商品化PCR纯化试剂 盒，纯化经Nde巧日化OI处理后的第SDNA序列，获得第四DNA序列。
[0050] S33:利用限制性内切酶处理表达载体pET2化质粒，获得线性化的祀T22b质粒，即 第五DNA序列；
[0化1 ] 具体地，表达载体pET2化质粒酶切的反应体系也为50化，包括:pET22b质粒39化， Nde巧日化Ol各化L，10倍浓度缓冲液扣レ反应条件为:37°C水浴解育4小时;再利用北京天根 公司生产的商品化的胶回收试剂盒进行纯化，获得线性化的第