一种籼稻川香29b成熟胚愈伤组织的遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养和基因工程技术领域。设及适用于=系釉型杂交水稻亲 本川香29B成熟胚愈伤组织的农杆菌介导的遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 农杆菌介导的遗传转化体系由于操作简单、T-DNA插入到基因组的拷贝数低、可W 转化大片段DNA等优点，已成为基因遗传转化的常规手段广泛应用于水稻基因功能研究和 分子育种中。水稻的胚性愈伤组织是农杆菌遗传转化的良好受体，其组培特性的好坏将直 接决定农杆菌介导水稻遗传转化能否成功。釉稻和梗稻是栽培稻的两个亚种，大多数梗稻 品种组培特性较好，愈伤组织诱导容易、增殖速度快、耐继代培养能力强、分化再生率高。许 多梗稻品种已经建立成熟的组培体系和遗传转化体系。而栽培面积广的大多数釉稻品种具 有不良的组培特性，其表现为愈伤组织诱导率和再生率低，后续继代培养中容易褐化，使得 釉稻遗传转化效率低，有的品种甚至难W进行转化，目前，虽然少数釉稻品种已经建立稳定 的组织培养体系和转化体系，但由于不同品种釉稻之间组培特性差别较大，不能适用于大 多数釉稻品种。高效、广泛适用的釉稻组织培养体系和转化体系尚未建立，特别是在生产上 有广泛应用价值的釉稻品种存在组织培养困难、遗传转化效率低等问题，极大地阻碍了釉 稻基因功能研究和基因的利用，因此，探索具有重要应用价值的某类或每种釉稻品种最适 的培养基和方法，W及遗传转化方法具有重要理论和实践意义，
[0003] 川香29B是优质釉型香稻保持系，其母本为川香29A具有开花习性好，异交结实率 高，抗病性强，米质优良且有香味等特点，利用川香29A已成功配制十多个杂交稻品种或组 合。该品种具有许多优良农艺性状，也是水稻重要农艺性状相关基因和香味基因定位研究 重要材料，我们系统地研究分析了培养基成分、激素、凝胶种类、碳源种类和浓度对生产上 广泛应用的优质釉稻品种川香29B成熟胚愈伤组织培养的影响，探索出的适合于川香29B的 植物组织培养基和方法，所获得的愈伤组织质量好、生长快、再生分化效率高(达90%)。在 此基础上研究了农杆菌的浓度、乙酷下酷酬的浓度等因素对遗传转化的影响，转化效率可 提高到26% W上，获得了非常理想的结果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供了一种釉稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其中 包括愈伤诱导、继代和分化、遗传转化过程，所诱导愈伤诱导率高、质量好，继代不易褐化， 分化效率高，在其他四种生产上广泛应用的釉稻品种(9311、明恢63、中9B，n-32B)中适用 性也较好，再生率为60-80 %之间，遗传转化效率高，可达26 % W上。
[0005] 本发明通过W下技术方案实现。
[0006] 本发明所述的一种釉稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，包括W下步骤：
[0007] 1)筛选适合于釉稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分，命名为醒L培养基。
[000引 大量元素：KN03(2.83g/L) ;KH2P04(0.4g/L) ;MgS04 ? 7出0(0.185g/L)CaCl2 (0.125g/L);(NH4)2S04(0.463g/L)。
[0009] 微量元素：1(1(0.83111邑/1);曲8〇3(6.2111邑/1);]\1115〇4.4此0(22.3111邑/1);2115〇4.7此0 (8.6mg/L);Na2Mo〇4 ? 2H2〇(0.25mg/L);CuS〇4 ? 5此0(0.025mg/L);CoCl2 ?細2〇(0.025mg/ Do
[0010] 铁盐：FeS〇4 ? 7出0(27.8mg/L);Na2-邸TA ? 2出0(37.3mg/L)。
[0011] 有机成分:烟酸（I.Omg/L);盐酸化唉醇(VBs) (I.Omg/L);盐酸硫胺素(VBi) (I .Omg/ L) ;Glycine(2.0mg/L);肌醇（lOOmg/L)。
[0012] 2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基。
[0013] 将釉稻成熟种子，去壳后，先用70-75%酒精浸泡Imin,然后用0.1%化Ch消毒6-8min;无菌水冲洗6次，然后将灭菌的釉稻成熟胚接入到愈伤组织诱导培养基中，在26-28 °C，暗环境下培养一个月的时间，诱导愈伤组织。
[0014] 诱导培养基配方为：在匪L培养基基本成分基础上，添加2,4-〇3.〇111肖几；1^-proline O.Sg/X;Glutamine O.Sg/X;水解酪蛋白0.6g/L;薦糖3〇g/X;F*h}ftagel 3.0-3.?/ L，pH 5.9。
[0015] 3)愈伤组织继代培养及继代培养基。
[0016] 将诱导出来的愈伤组织，挑取淡黄色，颗粒或块状的愈伤组织，接种到继代培养基 中，在26°C下暗环境培养，继代培养周期为15-20天。
[0017] 继代培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-〇3.〇111肖几山-prolineO . 5g/X;Glutamine 0.5g/X;水解酪蛋白0.8g/L;麦芽糖30.0 g/X;F*h}ftagel 3.0-3.2g/L,pH 5.9O
[0018] 4)愈伤组织预培养及预培养基。
[0019] 将上述继代2次的淡黄色颗粒状愈伤组织，接种到预培养基中，在26-28°C暗培养 3-5天，4天为宜。
[0020] 预培养基配方：1/2匪L大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2，4-D3. Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麦芽糖20.0 g/l;葡萄糖10.0 g/l;乙酷下酷酬(AS)200皿Ol/ レ琼脂7.0g/L，p册.4-5.6。
[0021 ] 5)农杆菌浸染釉稻愈伤组织。
[0022] 将携带双元载体的农杆菌先在YEB固体培养基(添加相应抗生素，如壮观霉素、卡 那霉素等)上划线培养，挑取单菌落在Y邸液体培养基中培养2-3天，收集农杆菌，用农杆菌 悬浮培养基悬浮农杆菌至00600 = 0.1-0.2之间，用此浓度农杆菌菌液浸染预培养后的愈伤 组织，常溫下浸染10-30min。
[0023] 农杆菌悬浮培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加 2，4-D 3.Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麦芽糖20.Og/l;葡萄糖10.Og/l;乙酷下酷酬(AS)20化 mol/L，pH5.2。
[0024] 6)农杆菌和愈伤组织共培养。
[0025] 将浸染后的愈伤组织置于灭菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力惊干60-90min，然后将愈伤组织接入到共培养基中，19-20°C暗环境下培养3天。
[0026] 共培养基配方：1/2匪L大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2，4-D3. Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麦芽糖20.0 g/l;葡萄糖10.0 g/l;乙酷下酷酬(AS)200皿Ol/ レ琼脂7.0g/L，p册.4-5.6。
[0027] 7)抗性愈伤筛选。
[00%]将共培养后的愈伤组织先用无菌水冲洗5-6次，最后一次用含400mg/L头抱霉素和 250mg/L的簇节青霉素浸泡10-20min，然后将愈伤置于无菌滤纸上，在超净工作台上开最大 风力惊干90-120min，接入到筛选培养基中，筛选两次，第一次筛选培养基添加8g/L琼脂作 为固化剂，培养条件为26-28°C暗培养15-20天;第二次筛选培养基添加3.2g/L的地ytagel 作为固化剂，培养条件为26-28°C暗培养，直至长出新的愈伤组织。
[0029] 筛选培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-〇3.〇111肖几；1^-prolineO.5g/l;Glutamine 0.5g/l;水解酪蛋白0.8g/l;麦芽糖30g/l;适量的载体上抗性 标记的筛选试剂(如潮霉素50mg/L);头抱霉素400mg/l;簇节青霉素250mg/l;琼脂8.Og/L或 Phy1:agel 3.0-3.2g/L，抑 5.9。
[0030] 8)抗性愈伤分化。
[0031] 将筛选出的抗性愈伤接种到分化培养基中进行植株再生，在26-28°C下，全天24h 光照培养，光照强度为2000-3000LUX，一个月后分化出幼苗。
[0032] 分化培养基配方：NML培养基基础上，添加6-BA3.5mg/L NAAO . 4mg/L ;山梨醇 15.0肖/1;薦糖20.0肖凡;水解酪蛋白0.6肖/1;适量的载体上抗性标记的筛选试剂（如潮霉素 50mg/L);头抱霉素400mg/l;簇节青霉素250mg/l;I%5rtagel 3.0-3.2g/L，pH 6.0
[0033] 9)幼苗生根培养。