马铃薯抗低温糖化分子标记组合及其在马铃薯抗低温糖化育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学与遗传育种领域，具体而言，设及马铃馨抗低溫糖化分子 标记组合及其在马铃馨抗低溫糖化育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃馨是（Solanum tuberrosum L.)世界第四大粮食作物，马铃馨加工在马铃馨 产业中占有重要地位，其中馨片馨条等马铃馨油炸加工产品因其食用方便和风味独特备受 青睐，所占份额最大。但油炸加工对马铃馨块茎品质的要求较高，除要求具有馨块大、芽眼 浅、馨肉白色等外观品质，更重要的是干物质含量需在20% W上，而且还原糖含量必须要低 于0.4% (鲜重）。如果块茎中积累的还原糖含量过高，在加工时产生Millard反应，致使馨片 或馨条表面颜色变褐，有的甚至糊化，口感变苦，也会生成有潜在神经毒性和致癌性的丙締 酷胺，严重影响产品加工品质。
[0003] 而在马铃馨加工产业中，为延长加工时间，减少因胆藏期间块茎失水皱缩、腐烂、 发芽等造成的原料损失，消除为抑制病虫害施用化学药剂而带来的健康问题和环境危害， 通常采用低溫(<l〇°C)的条件来胆藏收获后的马铃馨块茎。但低溫胆藏会加速淀粉向还原 糖的转化，造成还原糖含量的积累，但是运导致了马铃馨块茎中还原糖的积累，即所谓的低 溫糖化，运正是绝大多是品种不适合加工的主要原因。
[0004] 低溫糖化是一个复杂的生理学和生物化学过程，既是植物低溫诱导的自然反应， 同时又存在广泛的遗传变异和复杂的基因调控。已有一些研究从控制低溫糖化代谢网络相 关的遗传基础入手，力求掲示其遗传机制。化en等(2001)利用一个马铃馨双单倍体群体(2n = 24)，构建了第一个与马铃馨碳水化合物代谢相关的功能分子(moleculor-化nction)图 谱，定位了设及69个相关基因的85个WL标记。随后，Men自ndz等（2002)利用2个双单倍体群 体，针对低溫糖化性状筛选并定位了 26个WL标记。国内金黎平(2002)也利用二倍体群体， 通过AFLP和SSR标记进行了 WL定位，定位结果显示，19个WL分别分布在3、6、8、12、13、14、 15和16号连锁群上，解释的表型变异幅度为5.50%-70%。在关联分析方面，D'hoop(2002) 利用AFLP标记与馨片或馨条的色泽进行了相关分析，结果显示，经过4°C胆藏后块茎炸片色 泽相关标记位于马铃馨的1、6、7、8、9和12号染色体上，经过8°C胆藏后块茎炸片色泽相关标 记位于马铃馨的1、2、4、5、6、9和10号染色体上，其中8°C和4°C胆藏后炸片色泽只有一个位 点相重叠。所有运些研究都显示，马铃馨块茎的低溫糖化是一个能稳定遗传性状，存在利用 分子标记辅助选择的可能;但由于受多个遗传位点控制，因此，通过类似与质量性状的单个 分子标记很难达到理想的效果;再加上，马铃馨为同源四倍体作物，运将加大了常规选择育 种的难度。因此，解析马铃馨低溫糖化的抗性遗传机制，开发一组抗低溫糖化关联的分子标 记组合，对多个控制低溫糖化的WL进行检测，形成一个抗低溫糖化品系高效准确筛选方 法，将为马铃馨加工品种选育提供重要的技术支撑。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一组马铃馨抗低溫糖化基因型筛选的分子标记组合，所述 的分子标记组合对马铃馨抗低溫糖化基因型的选育具有较高的准确性，为马铃馨抗低溫糖 化材料的鉴定提供了基础，并建立用于抗低溫糖化育种分子标记辅助选择体系。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[000引马铃馨低溫糖化抗性的分子标记组合，所述分子标记为S3001-S3004核酸序列中 的任一种或多种；
[0009] S3001分子标记的上下游引物核酸序列如沈Q ID No.l和沈Q ID齡.2所示，53002 分子标记的上下游引物核酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，S3003分子标记的上 下游引物核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，S3004分子标记的上下游引物核酸 序列如沈Q ID No.7和沈Q ID No.8所示。
[0010] 其中，S3001和S3003分子标记位于马铃馨6号染色体，S3002分子标记位于马铃馨5 号染色体，S3004分子标记位于马铃馨7号染色体。
[0011] 本发明提供的马铃馨抗低溫糖化分子标记组合，运些分子标记通过对不同抗低溫 糖化能力的品种（系），进行相关分子标记多态性分析和低溫还原糖含量测定，并分析标记 和低溫糖化抗性之间的相关性，筛选得到用于建立抗低溫糖化育种分子标记辅助选择体系 的分子标记组合，该分子标记组合对抗低溫糖化马铃馨基因型筛选具有较高的准确性，为 马铃馨低溫糖化抗性株系鉴定和抗低溫糖化育种提供了技术支持。
[0012] 本发明还提供了所述的马铃馨抗低溫糖化性分子标记获得的方法，包括W下步 骤：
[0013] (a)、W母本邸25和父本CW2-1W及两者杂交产生的后代作为材料；
[0014] (b)、提取材料的基因组DNA;
[0015] (C)、利用SSR分子标记、AFLP分子标记W及根据基因组序列设计的分子标记，得到 在亲本之间具有多态性的引物，用于连锁图谱构建；
[0016] (d)、利用多态性引物对步骤(b)提取的两者杂交产生后代的基因组DNA进行扩增， 结合低溫下块茎还原糖含量测定测定结果，并进行互作分析，获得马铃馨抗低溫糖化的 QTL，计算OTL间的加性与上位性效应，得到所述的马铃馨抗低溫糖化分子标记组合。
[0017] 本发明提供的马铃馨抗低溫糖化分子标记的筛选方法，W母本抓25和父本CW2-1 W及两者杂交产生的后代作为材料，WSSR分子标记、AFLP分子标记W及根据基因组序列设 定的分子标记筛选马铃馨低溫糖化抗性的分子标记，进行候选基因多态性分析，同时对低 溫糖化抗性进行鉴定，进行候选基因标记和低溫糖化抗性之间的相关性分析，筛选得到用 于建立加工品质育种分子标记辅助选择体系的分子标记组合，为马铃馨低溫糖化抗性育种 W及马铃馨的加工提供技术基础。
[0018] 本发明还提供了一种马铃馨低溫糖化抗性的检测方法，是W上述的引物对马铃馨 样本的基因组提取物进行降落PCR扩增，分别对应得到S3001的PCR扩增产物、S3002的PCR扩 增产物、S3003的PCR扩增产物、S3004的PCR扩增产物；
[0019] S3001的PCR扩增产物和S3002的PCR扩增产物直接进行检测，S3003的PCR扩增产物 先采用Alu I酶酶切，酶切产物再进行检测，S3004的PCR扩增产物先采用Afa I酶酶切，酶切 产物然后进行检测；
[0020] 各分子标记采用的降落PCR扩增程序依次为:95°C预变性3min;94°C变性30s，58°C 退火30s，72°C延伸Imin，循环11次，每次循环退火溫度降0.5°C;94°C变性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 60s，循环 33 次;72°C 延伸 5min;4-10°C 保存。
[0021] 本发明提供的一种检测马铃馨低溫糖化抗性的方法，该方法选用上述分子标记对 待测样品的基因组进行降落PCR扩增，经多次试验验证，采用上述降落PCR体系W及程序，扩 增特异性强，无明显杂带出现，得到的扩增片段易于检测。由于分子标记为S3003和S3004 时，两者PCR扩增得到的产物没有多态性，因此，酶切后才能观察到其多态性，W实现鉴定的 目的。最终通过观察PCR扩增产物或PCR扩增产物酶切片段的多态性检测来判断马铃馨的低 溫糖化抗性，方便易行，为马铃馨低溫糖化分子标记辅助育种提供技术支持。
[0022] 为了得到的PCR扩增产物节约成本，易于观察，且不产生其他干扰条带，进一步地， 各分子标记的降落PCR体系均为15-2扣1;马铃馨样本的基因组提取物在降落PCR体系中的 添加量为50ngW上；更优选的马铃馨样本的基因组提取物在降落PCR体系中的添加量为 100-200ng。
[0023] 经试验发现，由S3001分子标记、S3002分子标记、S3003分子标记和S3004分子标记 组成的标记组合具有更好的低溫糖化抗性，优选地，检测马铃馨低溫糖化抗性采用的分子 标记组合为S3001分子标记、S3002分子标记、S3003分子标记和S3004分子标记。
[0024] 进一步地，检测抗低溫糖化马铃馨基因型表现为S3001无目标带，S3002分子标记、 S3003分子标记和S3004分子标记均有目标条带。
[0025] 优选地，所述