标记化合物和它们在测定中的用图

文档序号:9932203阅读:473来源:国知局
标记化合物和它们在测定中的用图
【专利说明】标巧化合物和它们在测定中的用途
[0001] 本申请要求2013年10月8日提交的英国专利申请1317787.8和2014年8月6日提交 的英国专利申请1413931.5的权益,其全部内容通过引用为了全部目的在此并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及二茂铁基标记化合物,W及运样的化合物在电化学测定和电化学检测 方法中的用途。
【背景技术】
[0003] 某些生物分子的检测在生活的许多方面起到重要作用。例如,在医疗领域,一直存 在检测细菌或病毒病原体,或生物分子的需要。其中灵敏的测定是必要的其它领域包括食 品和饮料工业。检测的一种方法包括使用电化学活性化合物。应用电化学检测具有优于诸 如巧光检测的其它方法的很多优点。电化学检测具有非常高的灵敏度水平的潜能并且显示 了比巧光更宽的线性动态范围。此外,不需要样品是光学上透明的。还存在来自背景污染物 的较少干扰(很多生物样品自动发巧光)。
[0004] W003/074731公开了电化学活性标记物W及探测核酸的方法。该方法包括使核酸 溶液与附接至电化学活性标记物的寡核巧酸探针接触。使探针至少部分地与可能存在于核 酸溶液中的任何互补的祀序列杂交。在核酸探针的酶促降解之后,电化学地确定与标记物 有关的f胃息。
[0005] Hillier等人(BioelechochemistiT 63(2004)307-310)描述了在脉冲电化学方 法中二茂铁脈化合物作为标记的用途,用于标记的寡核巧酸和酶解的标记的寡核巧酸之间 的电化学识别。
[0006] W02005/005657公开了进一步的电化学活性标记物和检测蛋白酶活性的方法。该 方法包括使样品溶液与附接至电化学活性标记物的蛋白酶底物接触,提供在其下存在于样 品中的任意蛋白酶可降解蛋白酶底物的条件。在降解之后,电化学地确定与标记物有关的 信息。
[0007] W02012/085591和W02013/190328描述了某些双二茂铁基化合物,用作电化学标 记。
[000引存在开发能够检测W低浓度存在的生物底物或指示剂一-例如核酸或氨基 酸一-的持续的需要。具体而言,存在对具有不同氧化电势和/或具有不同化学或物理性质 的新标记的持续的需要,由此拓宽可用的可能测定的范围和增加开发多重反应(multiplex reaction)的范围。此外,存在对可被在测定中用作内部对照的电化学活性化合物的需要。 运样的化合物需要提供稳健的、一致的电化学响应。

【发明内容】

[0009]本发明提供新的二茂铁基标记化合物、该化合物的官能化的衍生物,W及W该化 合物标记的底物。已经发现本发明的化合物是用于电化学测定中的有效标记。也已经发现 本发明的化合物提供稳健的、一致的电化学响应,氧化电势在-150mV和584mV之间,所W它 们可W在测定中被用作内部对照。当在测定中被用作探针时,本发明的化合物提供一致的 和可再现的峰高。此外,本发明的化合物显示了大的电化学范围,使得对内部对照标记的优 异调控处于伏安图(VO1 tammagram)的"干净"区域,即,远离(removed打om)其它峰的区域。 因此,本发明的化合物在多重测定中是非常有用的。
[0010] 本发明的化合物和标记的底物可W被用于任意其它电化学技术中,其中可利用它 们的电化学特性来获取关于标记或它们的环境的信息。
[0011] 本发明的实施方式提供具有通式I的化合物,
[0012]
[0013] 其中;
[0014] 每个X取代基独立地选自面基、乙締基、烷基、环烷基、SiRs、SnRs、PR2、P (0) R2、SR、S (0) R、SO2R、芳基、杂芳基、CHO、CO2R、CN 和 C的;
[0015] 每个R独立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基;
[0016] Y是间隔基;
[0017] Z是间隔基;
[0018] L是连接基团(linker group);
[0019] a是0、1、2、3或4;
[0020] b是0、1、2、3、4或 5;并且
[0021] 乙締基、烷基、环烷基、亚烷基、芳基和杂芳基可任选地被独立地选自未取代的烧 基、0H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。
[0022] 本发明的标记化合物和由其衍生的标记的底物提供使它们成为先前已知的标记 化合物的有用补充的特性,允许更宽的应用范围。例如,本发明的化合物和标记的底物可W 提供额外的机会,用于避免在其下测量电势可受到可能存在的杂质干扰的损害的条件。本 发明的化合物和标记的底物还提供不同的电化学电势值,潜在地允许多重测定中更大的灵 活性。
[0023] 标记物的电化学活性主要由二茂铁基基团上的取代基调节。因此,X、a和b的选择 可允许适当地选择化合物的电化学电势。进一步的精细调控可通过Y和Z的选择实现。
[0024] 在实施方式中,本发明设及通式IA的化合物,
[0025]
[0026] 其中;
[0027] 每个X取代基独立地选自面基、乙締基、烷基、环烷基、SiRs、SnRs、PR2、P(0)R2、SR、S (O) R、S02R、芳基、杂芳基、CHO、C02R、CN 和 CF3 ;
[0028] 每个财虫立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基;
[0029] A是0,B是C出,并且C是1,或
[0030] A是C出,B是0,并且C是2;
[0031] a是0、1、2、3或4;
[0032] b是0、1、2、3、4或 5;并且
[0033] 乙締基、烷基、环烷基、亚烷基、芳基和杂芳基可任选地被独立地选自未取代的烧 基、0H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。
[0034] 在另一个实施方式中,本发明提供通式IB的化合物,
[0035]
[0036] 其中;
[0037] 每个X取代基独立地选自面素、乙締基、烷基、环烷基、SiRs、SnRs、PR2、P(0)R2、SR、S (0) R、SO2R、芳基、杂芳基、CHO、CO2R、CN 和 CF3;
[0038] 每个财虫立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基;
[0039] A是0,B是C出,并且C是1,或
[0040] A是C出,B是0,并且C是2;并且
[0041] 乙締基、烷基、环烷基、亚烷基、芳基和杂芳基可任选地被独立地选自未取代的烧 基、0H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。
[0042] 优选地,在式I的化合物中,Y和Z均是亚烷基,其任一个或两者可任选地被独立地 选自未取代的烷基、〇H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。更优选地,Y是直 链亚烷基,其可被独立地选自〇H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代,并且Z是 Cl或C3-C8的亚烷基,其可被独立地选自未取代的烷基、0H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3 个取代基所取代。
[0043] 在本发明的化合物中,L是适合用于直接或通过本文中描述的官能化基团产生至 底物的连接的任意连接基团。L有利地是包括氧原子的连接基团。L优选地是径基或被护径 基。最优选地,L是径基。
[0044] 在本发明的化合物中,二茂铁基可只具有一个X取代基,使得a+b=l。在远端环戊 二締基环上,二茂铁基可W不具有取代基,使得b是0。在近端环戊二締基环上,二茂铁基可 只具有一个取代基,使得a是1。
[0045] 在本发明的化合物的实施方式中,每个X可W独立地选自面基、乙締基、烷基、环烧 基、SiR3、Sn化、P(O)化、53、5(0)1?、5〇21?、芳基、杂芳基、(:册、(:〇21?、〔闲掛:。3。在本发明的化合物 的另一个实施方式中,每个X可W独立地选自面基、乙締基、SR、S(0)R、烷基、P(0)R2、S(0)2R、 SiR3。在【具体实施方式】中,每个X独立地选自SR、S(0)R和S(0)2R。在另一个实施方式中,a是4, b是5,并且每个X是甲基。
[0046] 本发明的化合物是适合形成标记的底物的标记化合物。化合物附接至底物可W是 直接的(如,通过L)或通过官能化基团,优选地通过亚憐酷胺基团。因此,在实施方式中,本 发明提供本发明的化合物的官能化的衍生物的化合物。优选地,官能化的衍生物包括选自 班巧酷亚胺醋基团、亚憐酷胺基团、马来酷亚胺基团、生物素和叠氮基团的官能化部分。在 具体的实施方式中,官能化部分是亚憐酷胺基团。
[0047] 在另一个实施方式中,本发明提供W本发明的化合物标记的底物。可W被标记的 底物包括核酸、氨基酸、多肤、碳水化合物和任意运些分子的衍生物或合成的类似物。可能 被标记的其它底物包括胶乳/顺磁颗粒。
[0048] 在优选实施方式中,底物是核酸。优选地,核酸具有与选自下述的微生物中的序列 互补的序列:沙眼衣原体、阴道毛滴虫、淋病双球菌、生殖支原体和耐甲氧苯青霉素 (methicillin resistant)金黄色葡萄球菌。在实施方式中,底物不是腺巧。
[0049] 在另一个优选实施方式中,底物是氨基酸、多肤或碳水化合物;或包括至少2个核 巧酸的核酸。
[0050] 还提供了用于确定测定目标的存在的测定试剂盒,其中测定试剂盒包括本发明的 标记的底物。
[0051] 另一个实施方式提供了在电化学测定中本发明的任意实施方式的化合物作为标 记的用途。在【具体实施方式】中,测定用于检测电化学标记的底物。更具体地,测定用于确定 电化学标记的底物的量。例如,本发明的化合物可W在W003/074731中所描述方法,或 W02005/005657中所描述的方法中找到用途。
[0052] 另一个实施方式提供了制造式I的化合物的官能化的衍生物的方法,其包括使式I 的化合物与官能化化合物反应。在【具体实施方式】中,官能化化合物包括亚憐酷胺基团。
[0053] 还提供了用于制造标记的底物的方法,其包括使本发明的任意实施方式的化合物 与底物反应W获得标记的底物。
[0054] 另一个实施方式提供了检测样品中核酸的方法,其包括在允许探针与核酸之间杂 交的条件下使核酸与互补的核酸探针接触,其中探针由本发明的任意实施方式的化合物标 记。方法可W包括测量标记探针的化合物的电化学活性的进一步步骤。任选地,方法包括在 测量步骤之前,选择性地降解杂交的或未杂交的探针的步骤。杂交的探针的选择性降解可 W受到双链特异性核酸外切酶的影响。本发明的化合物的电化学活性可W定量地或定性地 取决于探针降解的程度。任选地,在使核酸与探针接触之前,扩增核酸(例如通过PCR或另一 核酸扩增技术)。
[0055] 另一个实施方式提供了检测W本发明的任意实施方式的化合物标记的底物的方 法,其包括测量化合物的电化学活性的步骤。在实施方式中,使用包括至少两种标记的测定 装置,每种标记包括根据本发明的化合物或标记的底物。
【具体实施方式】
[0056] 图1显示了从下面实施例22中描述的多重PCR测定获得的伏安图。
[0057] 图2显示了如实施例23中所描述,编录在一系列检测测定中使用3-(九甲基二茂铁 基甲氧基)丙-1-醇(实例化合物2)作为探针的图。
[005引术语"烷基"指具有1至8个碳原子,优选地1至6个碳原子,并且更优选地1至4个碳 原子的直链烷基,和具有3至8个碳原子,优选地3至6个碳原子的支链烷基。说明性烷基包括 甲基、乙基、正丙基、异丙基、正下基和叔下基。
[0059] 术语"环烷基"指具有3至8个环成员(ring member),优选地3至6个环成员的饱和 的或部分饱和的碳环karbocylic ring)。一个或多个环成员可W选自诸如氧、硫和氮的杂 原子。说明性环烷基基团包括环己基、环戊基、赃晚基和吗嘟基。
[0060] 术语"亚烷基"指具有1至8个碳原子,优选地1至6个碳原子,更优选地具有1至4个 碳原子的二价直链烷基自由基,或具有2至6个碳原子,优选地3至4个碳原子的二价支链烧 基自由基。
[0061] 术语"链締基"指具有2至6个碳原子,更优选地2至4个碳原子直链或支链链締基基 团。说明性的链締基包括乙締基、丙締基和下締基。
[0062] 术语"芳基"指具有5至10个碳成员的不饱和、芳香单环或双环。说明性芳基包括苯 基和糞基。
[0063] 术语"杂芳基"指具有5至10环成员并且其包含碳原子和1至4个杂原子的芳香单环 或双环芳香环系统,杂原子独立地选自诸如氧、硫和氮的杂原子。说明性的杂芳基包括巧喃 基、咪挫基和嚷挫基。
[0064] "面堂'或"面素'指氣、氯、漠和舰。
[0065] 术语"近端环戊二締基环"指附接有间隔基Y的环戊二締基环。术语"远端环戊二締 基环"指没有附接间隔基Y的环戊二締基环。
[0066] 对于取代基,术语"独立地"指当多于一个取代基是可能的时,取代基可W彼此相 同或不同的情况。
[0067] 除非与上下文明显相反,提及术语"底物"将被理解为包括天然出现的底物和合成 的底物。提及碳水化合物、核酸、氨基酸和多肤将被理解为指天然出现的或合成的碳水化合 物、核酸、氨基酸和多肤。
[0068] 术语"多肤"指由肤键连接的任意链的氨基酸,其包括两个或更多个氨基酸残基, 诸如二肤或复合蛋白。
[0069] 术语"核酸"指包括一个或多个核酸残基的分子,并且包括核巧酸、核巧、寡核巧酸 和多核巧酸,并且包括DNA和RNA。核酸可W包括1至50个核巧酸,更优选地2至40个核巧酸, 特别地15至35个核巧酸,18至30个核巧酸是特别优选的。对于一些应用,较短长度的底物可 能是有用的,例如具有1至14个核巧酸,更优选地2至10个核巧酸的核酸。核巧酸可W选自腺 巧、胸巧、鸟巧、胞巧或尿巧核巧酸。当核酸被附接至本文中提供的标记时,其优选地通过附 接至核巧酸的核糖或脱氧核糖基团的基团被附接,例如在2'、3'或5'位置,诸如通过氧或氮 原子。最优选地,在核巧酸的3'或5'位置上,例如在5'位置上,附接核酸。底物的核酸部分的 序列优选使得底物能够与互补的祀序列杂交,并且因此被用作分子生物技术一一例如,本 文中公开的核酸检测技术中的一种一一中的探针。
[0070] 术语"碳水化合物"指包括一个或多个糖残基的分子,并且包括单糖、寡糖和多糖。
[0071] 底物可W是单核巧酸和单氨基酸。在依靠裂解底物一一例如通过酶一一的测定的 情况中,单氨基酸或单核巧酸可W被看作底物,因为,虽然其缺少能够被酶裂解的内部键, 运样的键可W通过标记物的附接形成。在实施方式中,底物不是腺巧。
[0072] 在本文中设及天然出现的底物的衍生物的地方,那些衍生物可W是底物的天然出 现的衍生物或合成的衍生物。
[0073] 在核酸的上下文中提及术语"杂交"应被理解为表示第一核酸与互补序列的第二 核酸的特异性结合。还应理解的是,为了发生杂交,核酸序列的互补性不需要是完全的。杂 交包括互补结合,互补结合包括碱基错配至运样的错配将不实质性地降低描述的方法的效 率的程度。
[0074] 上面描述的发明的化合物可W直接附接至底物,或在化合物的官能化之后,和/或 或在底物的衍生化之后附接至底物。
[0075] 根据本发明的官能化的衍生物可W是根据式II的化合物:
[0076]
[0077] 其中;
[0078] 每个X取代基独立地选自面基、乙締基、烷基、环烷基、SiRs、SnRs、PR2、P (0) R2、SR、S (0) R、SO2R、芳基、杂芳基、CHO、CO2R、CN 和 C的;
[0079] 每个R独立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基;
[0080] Y是间隔基;
[0081 ] Z是间隔基;
[0082] F是官能化基团;
[0083] a是0、1、2、3或4;
[0084] b是0、1、2、3、4或 5;并且
[0085] 乙締基、烷基、环烷基、亚烷基、芳基和杂芳基可任选地被选自未取代的烷基、0H、 CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。
[0086] F可W衍生自式I的化合物中的L。优选地,F包括班巧酷亚胺醋基团、亚憐酷胺基 团、马来酷亚胺基团、生物素或叠氮基团。
[0087] 优选地,F是或包括亚憐酷胺基团。因此,官能化的衍生物可W是根据式IIA的化合 物:
[008引
[0089] :
[0090] 每个X取代基独立地选自面基、乙締基、烷基、环烷基、SiRs、SnRs、PR2、P(0)R2、SR、S (0) R、SO2R、芳基、杂芳基、CHO、CO2R、CN 和 CF3;
[0091 ] 每个财虫立地选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基;
[0092] A是0,B是C出,并且C是1,或
[0093] A是C出,B是0,并且C是2;
[0094] R'是烷基;
[00巧]R"是烷基;
[0096] a是0、1、2、3或4;
[0097] b是0、1、2、3、4或 5;并且
[0098] 乙締基、烷基、环烷基、亚烷基、芳基和杂芳基可任选地被独立地选自未取代的烧 基、0H、CN、氣、氯、漠和舰的1个、2个或3个取代基所取代。
[0099] 优选地R'是异丙基,并且R"是-C此C此CN。式IIA的化合物可通过利用官能化化合物 官能化式IA的化合物形成,官能化化合物包括亚憐酷胺基团。利用亚憐酷胺官能化特别有 利于将本发明的化合物附接至核酸。连接亚憐酷胺基团至核酸对本领域技术人员是已知的 并且是常规问题。
[0100] 根据本发明的标记的底物可W通过使本发明的化合物或官能化的衍生物与底物 反应制备。因此,标记的底物可W是式III,
[0101]
[0102] 具甲;
[0103] 每个X取代基独立地选自面基、乙締基、烷基、环烷基、SiR3、SnR3、PR2、P(0)R2、SR、S (0) R、SO2R、芳基、杂芳基、CHO、CO2R,CN 和 CF3;
[0104] 每个财虫立地选自烷基
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