检测遗传变体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及遗传变体的检测，包括用于检测遗传变体的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 群体中个体之间的遗传变异通常通过在一些情况下表现为疾病或障碍的表型改 变而观察。有些情况下，疾病或障碍仅表现为对外部刺激诸如药物或其他化学品的不良反 应。通过遗传检测进行药物不良反应(ADR)与患者遗传组成的关联研究有希望大大降低与 ADR相关的发病率和死亡率。在ADR与遗传变体之间存在若干已知的联系。
[0003] 氣尿喀晚（5-FU)已被用作治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌和其他癌症患者的化疗剂 达数十年。5-即的副作用包括腹泻、口腔炎、粘膜炎、神经毒性，并在一些情况下，包括死亡。 运些副作用主要是因为在遗传学上不能代谢该药物。二氨喀晚脱氨酶(DPDK-种由DH)基 因编码的酶）负责消除约80%标准剂量的5-FU。由于DTO基因突变导致的Dro缺乏已与严重 的5-即毒性相关联。已发现，约3-5 %的患者具有至少部分DTO缺乏。与Dro缺乏相关的最常 见突变是IVS14+1G〉A，其为在内含子14(称为DPD*2A)的剪接识别序列处发生的G〉A碱基改 变。该单核巧酸变异导致外显子跳读，并在DPD mRNA中产生165-bp的缺失。纯合子DPD*2A基 因型导致完全缺乏，而杂合的DPD*2A基因型导致DTO的部分缺乏。该代谢功能障碍的治疗前 检测可通过施用替代性处理而预防严重的5-RJ副作用。
[0004] 类似地，已报道了在用氯化格雷治疗的急性冠状动脉综合征(ACS)患者尤其是接 受经皮冠状动脉介入(PCI)的那些患者之中CYP2G19基因型与临床预后的联系。氯化格雷是 一种经常出现在处方中的口服抗血小板剂，其用于在冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血 管疾病中抑制血块。作为嚷吩并化晚前药，氯化格雷需要肝脏生物转化W形成活性代谢物。 肝CYP2C19酶是在参与氯化格雷代谢的CYP450超家族中的一种酶。CYP2C19基因是高度多态 性的，具有超过25种已知的变体等位基因。最常见的CYP2C19功能丧失性等位基因是 CYP2C19*2(c.681G〉A;rs4244285)，等位基因频率在高加索人和非洲人中为约15%，在亚洲 人中为29-35%。然而，当前针对功能丧失的遗传检测方法通常需要昂贵的仪器和长周转时 间。
[0005] 另一个实例是发现卡马西平引起的斯-琼综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/ TEN)与人白细胞抗原化LA)特定等位基因HLA-B*1502的密切联系。卡马西平是用于治疗患 有癒痛、神经性疼痛和双相情感障碍的一线药物。然而，卡马西平治疗可导致危险的或甚至 致命性的皮肤反应，诸如在具有HLA-B*1502等位变异的患者中的SJS和TENdHLA-B*1502等 位基因在亚洲人群（日本人和韩国人除外）中的出现率远高于在高加索人和非洲人群中的 出现率。一些研究掲示:对卡马西平引起的SJS进行的HLA-B*1502检测的阴性预测值可接近 100% "HLA-B基因是高度多态性的，具有超过2000个独特的等位基因，运使得特定等位基因 的测定复杂化。Sanger测序被视为HLA分型的金标准。然而，相位多值性(ambigui ty)在等位 基因组合的鉴定中经常导致SBT存在问题。下一代测序(NGS)技术能够获得单个DNA分子的 序列，并可排除相位多值性，但当前NGS方法的缺点包括读取长度短、文库制备工作量高和 处理时间长。最近的报道将环介导等溫扩增化AMP)用于HLA-B*1502筛查（Cheng，et al.Clin.Chem. 2009，55，1568.)。遗憾的是，运些方法的特异性不足W将HLA-B*1502与相当 多的在一些群体中不稀有的其他等位基因区分开来。错误的测定会将SJS风险极低的患者 从有效的卡马西平疗法中排除，并增加治疗成本。由于HLA-B*1502筛查的成本效益高度依 赖于遗传检测的准确性和成本，因此迫切需要特异性更高且成本更低的新测定法。
[0006] 美国食品药品监督管理局(抑A)和其他监管机构已要求对若干在某些基因型中可 能具有副作用的药物在标签上注明。例如，对基于氣尿喀晚(5-即)的药物的要求是要包括 在一些个体中发生超敏反应的警告。又如，美国食品药品监督管理局在2007年发出警示:建 议在用卡马西平开始治疗其祖先来自存在特定等位基因的地区的患者之前对HLA-B*1502 等位基因进行筛查。类似地，卡马西平标签上的黑框警告建议在具有ACS或PCI的弱代谢者 中考虑使用替代抗血小板疗法。
[0007] 对于一些遗传变体而言，可W得到用于基因分型检测的商业试剂盒，将运些试剂 盒用于预测个体对药物是否耐受。所用的试验平台包括Sanger测序和限制性片段长度多态 性(RFLP)分析。基于运些平台的测定法要么耗时要么昂贵，因此不太适于按需检测。也可W 获得基于实时PCR的商业试剂盒，遗憾的是，运些方法的特异性不足W将复杂的等位变体与 相当多的在一些群体中不稀有的其他等位基因区分开来。由于筛查的成本效益高度依赖于 遗传检测的准确性和成本，因此迫切需要特异性更高且成本更低的新测定法。
【发明内容】
[000引本发明通过在本发明第一方面中提供一种检测与疾病或障碍包括与药物不相容 性相关的遗传变体的方法而满足此需求，该方法包括W下步骤：
[0009] a)提供偶合到至少一个吗嘟代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含祀互补区， 所述祀互补区含有与遗传变体完全匹配的碱基序列；
[0010] b)在允许吗嘟代核酸探针和疑似含有遗传变体的核酸杂交的条件下将包含疑似 含有遗传变体的核酸的样品与第一纳米粒子合并W提供第一混合物；
[0011] C)依序加热第一混合物并测定吗嘟代核酸探针与疑似含有遗传变体的核酸之间 的杂交复合物的解链溫度；
[0012] d)将步骤C)中测定的解链溫度与标准进行比较W确定样品是否包含含有遗传变 体的核酸。
[0013] 本发明的另一个方面设及一种用于执行本文所述的方法的检测试剂盒，该试剂盒 包含:偶合到至少一个吗嘟代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含祀互补区，所述祀互补 区含有与遗传变体序列完全匹配的碱基序列，遗传变体序列与疾病或障碍包括与药物不相 容性相关。
[0014] 参照W下附图和对多种非限制性实施方案的描述，本发明的其他方面对本领域的 技术人员将显而易见。
【附图说明】
[0015] 附图未必按比例绘制，相反，重点通常在于阐述多种实施方案的原理。在W下描述 中，参照W下附图描述本发明的多种实施方案。
[0016] 图I.用于DTO测试的MOR的序列。每对探针的单碱基差异带有下划线。
[0017] 图2.用于DPD基因型分析的合成DNA样品的序列。单核巧酸多态性(SNP)位置带有 下划线。
[001引图3.用于DPD祀序列扩增的PCR引物。
[0019] 图4.用于DPD序列PCR扩增的热循环仪方案。
[0020] 图5.随着祀向DPD*2A SNP的(a)WT和(b)MUT探针的DPD祀浓度而变化的解链溫度。 样品为合成的单链野生型DNA(圆形）、突变型DNA(方形)及其1:1混合物(S角形，代表杂合 子样品）DTm测量误差=± TC。
[0021] 图6.DPD合成DNA样品的Tm"和TmMUT的散点图。Tm测量误差=± rc。
[0022] 图7.典型HLA-B等位基因的比对。
[0023] 图8.用于HLA-B* 1502等位基因测定的PCR引物和探针设计。
[0024] 图9. PCRl的HLA-B等位基因中的组合多值性(ambiguitieS)。
[002引图10.用于HLA-B测试的MOR的序列。
[0026] 图11.用于HLA-B基因型分析的合成DNA样品的序列。核巧酸变体通过下划线突出 显示。
[0027] 图13.用于HLA-B测试的PCR引物的序列。
[002引图14.用于HLA-B序列PCR扩增的热循环仪方案。
[0029] 图15.随着用于HLA-B测试的纳米探针1、2和3的祀浓度而变化的解链溫度。
[0030] 图16.用于CYP2C19测试的MOR的序列。单碱基差异通过下划线突出显示。
[00川图17.随着祀向CYP2C19*2SNP的(a)WT和(b)MUT探针的祀浓度而变化的解链溫度。 样品为合成的单链野生型DNA(圆形）、突变型DNA(方形)及其1:1混合物(S角形，代表杂合 子样品）DTm测量误差=± TC。
[0032] 图18.用于本研究的CYP2C19合成DNA样品的序列。SNP位置通过下划线突出显示。
[00削图19.CYP2C19合成DNA样品的Tm"和Tm*T的散点图。Tm测量误差=± TC。
[0034] 图20.用于CYP2C19祀序列扩增的PCR引物。
[00巧]图21.用于CYP2C19PCR扩增的热循环仪方案。
【具体实施方式】
[0036] 本发明人开发了一种经济有效的使用偶合到特定吗嘟代寡核巧酸序列的纳米探 针的基因分型平台。相应的测定试剂盒可大大促进药物基因组学知识在临床实践中的转 化。
[0037] 本发明的第一方面设及一种检测与疾病或障碍包括与药物不相容性相关的遗传 变体的方法，该方法包括W下步骤：
[0038] a)提供偶合到至少一个吗嘟代核酸探针的第一纳米粒子，该探针包含祀互补区， 所述祀互补区含有与遗传变体完全匹配的碱基序列；
[0039] b)在允许吗嘟代核酸探针和疑似含有遗传变体的核酸杂交的条件下将包含疑似 含有遗传变体的核酸的样品与第一纳米粒子合并W提供第一混合物；
[0040] C)依序加热第一混合物并测定吗嘟代核酸探针与疑似含有遗传变体的核酸之间 的杂交复合物的解链溫度；
[0041] d)将步骤c)中测定的解链溫度与标准进行比较W确定样品是否包含含有遗传变 体的核酸。
[0042] 如本文所用的术语"遗传变体(genetic variant)"是指不同于群体的优势基因型 的天然存在的基因序列，其导致与疾病或障碍相关的表型变化，包括与药物不相容性。优势 基因型可定义为存在于大部分群体中的序列或最常见的基因型。在多种实施方案中，优势 基因型包括在至少55 %的群体中、或至少60 %、或至少70 %、或至少80%、或至少90%、或至 少95%的群体中相同的基因序列。在本文中，术语"优势基因型"也称为"野生型"。因此，野 生型或优势序列不包括导致疾病或障碍的遗传变异。遗传变体的实例包括核酸缺失、核酸 添加、单核巧酸多态性(SNP)或等位变体。如本文所用的术语"遗传变体"因此意指给定基因 的碱基序列中的特定变异。
[0043] 本发明的吗嘟代核酸为二氨基憐酸吗嘟代寡核巧酸(PMO)，其中糖和憐酸骨架被 氨基憐酸连接的吗嘟基团取代，并且诸如胞喀晚、鸟嚷岭、腺嚷岭、胸腺喀晚和尿喀晚，优选 腺嚷岭、鸟嚷岭、胞喀晚和胸腺喀晚的核碱基偶合到吗嘟环。PMO通常包括W下结构的单体 单元-
[0044
[0045] 术语"吗嘟代(mo巧holino)"、"吗嘟代核酸"和"吗嘟代(寡)核巧酸"在本文可互换 使用，并指代上述二氨基憐酸吗嘟代寡核巧酸(PMO)。
[0046] 在多种实施方案中，吗嘟代寡核巧酸共价偶合到纳米粒子。运可W例如经由5'-端 氨基憐酸基团或3'-端环氮而实现。本文所述的吗嘟代寡核巧酸的长度可包括约5个单体单 元至约40个单体单元、约10个单体单元至约35个单体单元或约15个单体单元至约35个单体 单元。