灵芝烯酸及其制备方法和用图
【专利摘要】灵芝烯酸及其制备方法和用途。本发明属于医药技术领域，具体是从天然产物中提取活性成分的方法和活性成分用途，更具体是从弱光泽灵芝中提取灵芝烯酸的方法和灵芝烯酸的用途。本发明的灵芝烯酸制备方法，其特征在于：弱光泽灵芝经过提取、萃取、硅胶柱层析、ODS柱层析、制备液相分离得到五个灵芝烯酸，并进行了这五个灵芝烯酸抑制LPS诱导BV?2小胶质细胞释放NO的活性实验。结果表明，化合物(1)～(5)能较好的抑制LPS诱导BV?2小胶质细胞释放NO，且对BV?2小胶质细胞的存活率无影响，可能成为先导化合物。
【专利说明】
灵芝烯酸及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体是从天然产物中提取活性成分的方法和活性成分 用途。
【背景技术】
[0002] 神经退行性病变是一类以神经元丧失正常的功能和结构甚至死亡为病理特征的 疾病，包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)，多发性硬化(MS)等，这些疾病的发生与发展 都与神经炎症密切相关。神经炎症反应介导的神经元退行性病变主要是由胶质细胞的激活 及外周入侵的淋巴细胞释放神经毒性因子所引起的。小胶质细胞BV-2是神经系统常驻的免 疫细胞。持续或过度活化的小胶质细胞介导神经炎症，释放包括白细胞介素1KIL-10)、肿 瘤坏死因子a (TNF-a)、一氧化氮（nitric oxide，N0)、前列腺素及活性氧簇(reactive oxygen species，R0S)等在内的炎症介质，直接或间接损伤神经元，导致继发性神经损伤。 近年来的研究发现，抑制小胶质细胞BV-2激活及其介导的炎症反应可显著减少神经毒性物 质释放，减轻神经功能损伤。
[0003] 灵芝是灵芝科真菌的总称，属于真菌界，担子菌门，担子菌纲，非褶菌目的一类高 等担子菌，是我国历代医药学家推崇的滋补强壮、扶正培本的珍贵药品，久服有轻身延年的 功效。《神农本草经》将灵芝列为上品。关于灵芝化学成分及其生物活性研究，多年来一直都 是国内外药学领域的研究热点之一。但绝大部分的研究集中在赤芝Ganoderma Lucidum这 个品种，偶有涉及紫芝Ganoderma sinense、松杉灵芝Ganoderma tsugae、薄盖灵芝 Ganoderma capense、树舌灵芝Ganoderma applanatum等品种。
[0004] 弱光泽灵芝Ganoderma curtisii(Berk. )Murrill在国内河北、江西、湖南、海南、 四川、云南均发现有分布，本课题组在前期调研中首次发现其在广西境内有分布，标本样品 现收于中国科学院微生物研究所国家菌物标本馆。本课题组前期工作中采用薄层色谱 (TLC)分析比对了弱光泽灵芝与赤芝的化学成分，发现弱光泽灵芝与赤芝含有相类似的次 生代谢产物，但二者之间也具有明显的差异，对其药学及药效学方面的研究目前未见国内 外文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供从弱光泽灵芝中提取灵芝烯酸的方法和灵芝烯酸的用途。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007] 1.五个灵芝烯酸，结构式为：
[0009] 2.灵芝烯酸的制备方法，其特征在于：弱光泽灵芝经过提取、萃取、硅胶柱层析、 0DS柱层析、制备液相分离得到五个灵芝烯酸。
[0010] 3.灵芝烯酸抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放N0的活性。
[0011] 本发明的益效如下：
[0012] 1.进行了弱光泽灵芝的药学研究且得到积极的结果，纠正了之前人们普遍认为其 效果不佳而不进行研究的技术偏见，为进一步应用提供理论依据。
[0013] 2.提供了神经退行性病变的可能先导化合物。
【附图说明】
[0014] 图1为化合物（1)的1H-NMR
[0015] 图2为化合物(1)的13C-NMR
[0016] 图3为化合物(2)的1H-NMR
[0017] 图4为化合物⑵的13C-NMR
[0018] 图5为化合物(3)的1H-NMR
[0019] 图6为化合物⑶的13C-NMR
[0020] 图7为化合物(4)的1H-NMR
[0021] 图8为化合物(4)的13C-NMR
[0022] 图9为化合物(5)的1H-NMR
[0023] 图10为化合物(5)的13C_NMR
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0025] 实施例1
[0026]化合物提取：弱光泽灵芝的子实体20kg打成粗粉，用10倍重量的85% (体积比，下 同）乙醇回流提取3次，每次2小时。合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得浸膏670克。将浸膏分 散于5升水中，依次用与水等体积的乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，减压蒸去溶剂后分别得乙 酸乙酯层LE(550g)、正丁醇层LB和水层提取物。
[0027] 称取2000g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用550g 200-300目的柱层析硅胶将 乙酸乙酯层LE拌样后过柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脱，等体积接收流出液， 点板后合并，减压浓缩得到10个流分，编号LE1~LE10,其中LE6为142.2g。
[0028] 称取800g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用142g 200-300目的柱层析硅胶将 LE6拌样后过柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合 并，减压浓缩得到7个流分，编号LE61~LE67，其中LE64为26.7g。
[0029]称取150g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用27g 200-300目的柱层析硅胶将 LE64拌样后过柱，二氯甲烷：乙酸乙酯（10:1~0:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合 并，减压浓缩得到7个流分，编号LE641~LE647，其中LE646为14.5g。
[0030] 将LE646过开放0DS柱，甲醇：水(30: 70~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点 板后合并，减压浓缩得到7个流分，编号LE6461~LE6467，其中LE6462为6.7g。
[0031] 将LE6462过开放0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点 板后合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE64621~LE64624，其中LE64622为0.92g。
[0032] 将LE64622过制备液相，用乙腈:水:磷酸=33:67:0.1做流动相，等体积接收流出 液，点板后合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE64621~LE64624，其中LE646223为0.48g，用 上述条件过制备液相，得到化合物（1) 10.8mg(3LE646224为0.28g，用上述条件过制备液相， 得到化合物(4)15.7mg。
[0033] 称取650g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用100g 200-300目的柱层析硅胶将 LE63(102g)拌样后过柱，环己烷：乙酸乙酯（10:1~1:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板 后合并，减压浓缩得到7个流分，编号LE631~LE637,其中LE636为25.2g。
[0034] 将LE636过开放0DS柱，甲醇:水（10:90~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点 板后合并，减压浓缩得到6个流分，编号LE6361~LE6366，其中LE6363为7.8g，将其过开放 0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压浓缩得到6 个流分，编号 LE63631 ~LE63636，其中 LE63634为 2.6g。
[0035] 将LE63634过制备液相，用乙腈：水:磷酸=43 : 57 : 0.1做流动相，得到化合物（3) 24mg〇
[0036] 将LE6364(4. Og)过开放0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流 出液，点板后合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE63641~LE63644，其中LE63643为3.3g，将 其反复过制备液相，用乙腈:水:磷酸=42:58:0.1做流动相，得到化合物(2) 5.7mg。
[0037] 将LE8(40 ? 5g)过HP-20大孔树脂柱，树脂用量2000g。乙醇：水（10:90~95:5)梯度 洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压浓缩得到5个流分，编号LE81~LE5，其中LE84为 16.2g〇
[0038] 称取80g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用16g 200-300目的柱层析硅胶将LE84 拌样后过柱，二氯甲烷：甲醇（15:1~2:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压 浓缩得到6个流分，编号LE841~LE846，其中LE845为4.2g。
[0039] 将LE845过开放0DS柱，甲醇:水（10:90~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点 板后合并，减压浓缩得到6个流分，编号LE8451~LE8456，其中LE8454为1. lg，将其反复过制 备液相，用乙腈:水:磷酸=30:70:0.1做流动相，得到化合物(5) 7.8mg。
[0040]化合物(1)~(5)的结构式如下：
[0042]通过SciFinder检索，未发现化合物(1)有相关报道，说明这是一个新化合物。
[0043]药理活性实验：化合物（1)~（5)及阳性药槲皮素均用DMS0溶解并稀释至合适浓 度，-20°C保存备用。将BV-2小胶质细胞调整为2X105个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每 孔加入l〇〇yL细胞悬浮液，37 °C、5 %⑶2隔夜培养后，各孔按以下分组情况加样：（1)脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)组不加入被测试样品；（2)空白对照组(等体积DMS0); (3)经LPS 预处理的不同浓度的化合物（1)~（5)(加入终浓度为lyg/mL的LPS孵育30min，再分别加入 浓度为40、20、10、2.5、1.0、0.5、0. lyM的样品），每个浓度设3个平行孔。在37°C、5 %C02恒温 培养箱中培养24h后，吸取培养液上清100此至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反 应15min后测定540nm处的吸光值。用浓度分别为1、2、5、10、20、40、60、100_〇1/1的恥勵 2绘 制标准曲线，根据NaN02标准曲线计算细胞培养上清液中MV的浓度以及对N0释放的抑制 率，抑制率计算公式为：
[0045] 具体实验结果见Table 1:
[0046] Table 1 Inhibitory effect of compounds 1-5 on NO production LPS-induced in BV_2(x土s，n = 3)
[0048] NO concentration of control group: 1.02±0.18tiM
[0049] NO concentration of LPS-treated group:10?04±1?25uM
[0050] #Positive control
[00511结果表明，化合物⑴~(5)能较好的抑制LPS诱导BV-2小胶质细胞释放NO。
[0052] 在上述培养板每孔中加入MTT溶液(终浓度200yg/mL)，置于37°C、5%C02培养箱中 继续培养4h后，弃去上清，吸干残留液体，加入DMS0 150yL，振摇10min使生成的甲瓒结晶充 分溶解后，以630nm为参比波长在570nm下测定吸光值。细胞存活率计算公式为：
[0054]结果表明，化合物（1)~（5)对BV-2小胶质细胞的存活率无影响，可能成为先导化 合物。
【主权项】
1. 如化合物（1)的灵芝烯酸：2. 灵芝烯酸的制备方法，其特征在于：弱光泽灵芝经过提取、萃取、硅胶柱层析、ODS柱 层析、制备液相分离得到如权利要求1所述化合物(1)和化合物(2)~(5)的灵芝烯酸：3. 如权利要求2所述灵芝烯酸的制备方法，其特征在于:弱光泽灵芝子实体20kg打成粗 粉，用10倍重量的85% (体积比，下同）乙醇回流提取3次，每次2小时;合并提取液，减压浓缩 回收乙醇，得浸膏670克；将浸膏分散于5升水中，依次用与水等体积的乙酸乙酯、正丁醇各 萃取3次，减压蒸去溶剂后分别得乙酸乙酯层LE(550g)、正丁醇层LB和水层提取物； 称取2000g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用550g 200-300目的柱层析硅胶将乙酸 乙酯层LE拌样后过柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板 后合并，减压浓缩得到10个流分，编号LE1~LE10,其中LE6为142.2g; 称取800g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用142g 200-300目的柱层析硅胶将LE6拌 样后过柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压 浓缩得到7个流分，编号LE61~LE67,其中LE64为26.7g; 称取150g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用27g 200-300目的柱层析硅胶将LE64拌 样后过柱，二氯甲烷：乙酸乙酯（10:1~0:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减 压浓缩得到7个流分，编号LE641~LE647，其中LE646为14.5g; 将LE646过开放ODS柱，甲醇:水(30: 70~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后 合并，减压浓缩得到7个流分，编号LE6461~LE6467,其中LE6462为6.7g; 将LE6462过开放ODS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后 合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE64621~LE64624，其中LE64622为0.92g; 将LE64622过制备液相，用乙腈:水:磷酸=33:67:0.1做流动相，等体积接收流出液，点 板后合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE64621~LE64624，其中LE646223为0.48g，用上述 条件过制备液相，得到如权利要求1所述化合物（1) 10.8mg; LE646224为0.28g，用上述条件 过制备液相，得到如权利要求2所述化合物(4) 15.7mg; 称取650g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用100g 200-300目的柱层析硅胶将LE63 (102g)拌样后过柱，环己烷：乙酸乙酯（10:1~1:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合 并，减压浓缩得到7个流分，编号LE631~LE637,其中LE636为25.2g; 将LE636过开放ODS柱，甲醇：水（10: 90~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后 合并，减压浓缩得到6个流分，编号LE6361~LE6366，其中LE6363为7.8g，将其过开放0DS柱， 甲醇：水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压浓缩得到6个流 分，编号 LE63631 ~LE63636，其中LE63634为 2 · 6g; 将LE63634过制备液相，用乙腈:水:磷酸=43:57:0.1做流动相，得到如权利要求2所述 化合物(3)24mg; 将LE6364 (4.0g)过开放ODS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液， 点板后合并，减压浓缩得到4个流分，编号LE63641~LE63644，其中LE63643为3.3g，将其反 复过制备液相，用乙腈:水:磷酸= 42:58:0.1做流动相，得到如权利要求2所述化合物（2) 5.7mg； 将LE8(40.5g)过HP-20大孔树脂柱，树脂用量2000g;乙醇:水（10:90~95:5)梯度洗脱， 等体积接收流出液，点板后合并，减压浓缩得到5个流分，编号LE81~LE5，其中LE84为 16.2g； 称取80g的200-300目的柱层析硅胶，装柱，用16g 200-300目的柱层析硅胶将LE84拌样 后过柱，二氯甲烷：甲醇（15:1~2:1)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后合并，减压浓缩 得到6个流分，编号LE841~LE846，其中LE845为4.2g; 将LE845过开放ODS柱，甲醇:水（10: 90~100:0)梯度洗脱，等体积接收流出液，点板后 合并，减压浓缩得到6个流分，编号LE8451~LE8456,其中LE8454为l.lg，将其反复过制备液 相，用乙腈:水:磷酸=30:70:0.1做流动相，得到如权利要求2所述化合物(5) 7.8mg。4. 灵芝烯酸在制备神经退行性病变药物的用途。5. 如权利要求1所述化合物（1)和如权利要求2所述化合物(2)~(5)的灵芝烯酸在制备 神经退行性病变药物的用途。6. 如权利要求1所述化合物（1)和如权利要求2所述化合物(2)~(5)的灵芝烯酸在制备 抑制脂多糖诱导BV-2小胶质细胞释放一氧化氮药物的用途。
【文档编号】C07J9/00GK105820204SQ201610148142
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月16日
【发明人】邱莉, 谢集照, 焦杨, 邹录惠, 谢婷, 韦倩
【申请人】广西医科大学