对hpv18e7蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用

对hpv18 e7蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种对HPV18E7具有结合亲和力的多肽及其应用，首次揭示了一种对HPV18的E7蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。
【专利说明】
对HPV18 E7蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程领域，具体是一种对HPV18E7(人乳头瘤病毒18型的E7蛋 白）具有结合亲和力的多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是威胁人类健康和生命的主要疾病，在女性的癌症发病率居第二位，仅次 于乳腺癌，在发展中国家更为多见，近几年甚至出现年轻化的趋势。在我国，每年宫颈癌的 新病例大概是13.15万，占全世界的1/7,宫颈癌的发病率和死亡率居全球第二位。虽然近60 年来，国内外的学者们进行了大量研究，并且宫颈癌的预防疫苗已经上市，但由于多方面因 素的共同存在，目前临床对于宫颈癌的治疗，效果仍不理想。
[0003] 人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的重要病因。流行病 学研究表明90%以上的宫颈癌与HPV感染相关，尤其是高危型HPV中的HPV16和18型，宫颈鳞 状细胞癌中，HPV 16型感染阳性占51%以上，而宫颈腺癌中HPV 18型感染阳性占56% APV基 因组约有8 000 bp，结构上由早期转录区（Early transcribed region，E区）、晚期转录区 (Late transcribed region，L区）和非编码区（Non-coding region，URR)组成。E区有E1、 E2、E4、E5、E6、E7等6个开放读码框(Open reading frame，0RF)，它们编码的蛋白均参与病 毒复制与转录的过程，其中E6和E7为肿瘤原性蛋白，E6与P53结合，E7和pRB蛋白结合，诱导 感染细胞发生转化，细胞因复制失控而致永生化。
[0004]亲和体分子，英文名affibody，是一类親新的亲和性配体，其结构由58个氨基酸 组成、相对分子量小，约为6.5 X 103，其功能类似于抗体，可与相应的抗原、受体或配体结 合，但又有着一些抗体所没有的性质，如相对分子量小，仅为6.5 X 103、折叠速率快、选择性 和亲和力高，以及理化性质稳定，可耐受化学修饰等，因此人们称其为"人工抗体"。 affibody分子所具备的这些独特性质，使其在各个免疫学领域和生物科学领域中迎来了 广阔的应用前景，从20世纪80年代首次报道以来，研究者们便对其产生了浓厚的兴趣，因 此它的发展也极为迅速。
[0005] 基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗HPV相关肿瘤疾病的新药物或新 方法，以改善目前临床现状。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种HPV18E7具有 结合亲和力的多肽及其应用。
[0007] 本发明的第一个目的，其技术方案是一种对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结 合亲和力的多肽，其特征在于:该多肽是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进 行12-20个氨基酸变异后获得的多肽。
[0008] 进一步设置是相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，该多肽在第9-11，13_ 14，17-18，24-25，27-28，32，35，43 位上发生氨基酸突变。
[0009] 进一步设置是相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，该多肽的： 第9位氨基酸突变为P、F或A; 第10位氨基酸突变为F、L或V; 第11位氨基酸突变为C、L或R; 第13位氨基酸突变为R、M或S; 第14位氨基酸突变为Q、V或G; 第17位氨基酸突变为S、F或A; 第18位氨基酸突变为P、W或V; 第24位氨基酸突变为H、E或P; 第25位氨基酸突变为H或E; 第27位氨基酸突变为E、A或D; 第28位氨基酸突变为P、E或L; 第32位氨基酸突变为G、R或P; 第35位氨基酸突变为P、H、Q或V; 第43位氨基酸突变为E、D或K。
[0010] 进一步设置是该多肽与人乳头瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值为IX 1(T6M 至3X10-7M〇
[0011] 本发明的第二个目的，提供一种靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子，所述的靶 向性分子包括前文所述的任一多肽，以及与该多肽相连接(或偶联）的偶联物，所述的偶联 物包括:半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒18型的药物，或可检测标记物(如荧 光标记，酶，生物素或放射性同位素）。
[0012] 本设置中，所述的偶联物与所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和 力的多肽构成融合多肽。本设置中，所述的多肽标签包括但不限于:His标签(如6XHis)， Myc标签，GST标签，Flag标签，所述酶包括但不限于:碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0013] 进一步设置是所述的抑制人乳头瘤病毒18型的药物包括:毒素;所述毒素是具 有抑制人乳头瘤病毒18型病毒感染或抑制肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓 杆菌外毒素或所述毒素的功能性片段;且所述的肿瘤是人乳头瘤病毒18型阳性的肿瘤。
[0014] 本设置中，所述的毒素是绿脓杆菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是绿脓杆菌 外毒素A的活性片段PE38KDEL。较佳地，该绿脓杆菌外毒素A或其功能性片段连接于所述 的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽的羧基末端(C末端）。本设置中， 所述的偶联物与所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽以柔性肽 连接，所述柔性肽包括(但不限于）：（Gly4Se r)3。
[0015] 本发明的第三个目的，提供一种分离的多核苷酸，其编码前文任一所述的对人乳 头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽。
[0016] 本发明的第四个目的，提供一种多核苷酸，其编码前文所述的靶向人乳头瘤病毒 18型的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。
[0017] 本发明的第五个目的，提供一种重组载体，该载体包含前文所述的多核苷酸。
[0018] 本发明的第六个目的，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含前文所述的重组载体， 或其包含有或基因组中整合有前文所述的多核苷酸。
[0019] 本发明的第七个目的，提供一种制备前文所述的任一对人乳头瘤病毒18型的 E7蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培养前文所述的细胞，从而表达前文所述任一的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白 具有结合亲和力的多肽； (2) 分离纯化(1)获得的多肽。
[0020] 本发明的第八个目的，提供一种前文所述的任一对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白 具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制备 治疗人乳头瘤病毒18型感染疾病或人乳头瘤病毒18型表达阳性肿瘤的药物;或用于制备 检测人乳头瘤病毒18型病毒感染的检测试剂;或用于制备诊断人乳头瘤病毒18型感染疾 病或人乳头瘤病毒18型表达阳性肿瘤的诊断试剂。
[0021 ]本发明的第九个目的，提供一种药物组合物，其包括前文所述的对人乳头瘤病毒 18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求5或6所述的靶向人乳头瘤病毒18型 的靶向性分子;和药学上可接受的载体。
[0022]本发明的第十个目的，提供一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒18型感染疾病或 人乳头瘤病毒18型表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括:前文所述的任一对人乳头瘤 病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，或前文所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶 向性分子，或前文所述的药物组合物。
[0023 ]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做进一步介绍。
【附图说明】
[0024] 图1重组质粒pET21a( + )/HPV16E7酶切鉴定图； 图1中：Ml:lkbDNAmarker; 1: pET21a( + )质粒2: pET21a( + )/HPV18E7; 3: pET21a ( + )/HPV18E7//NdeI+XhoI;4: HPV18E7 DNA片段；M2: DL2000 DNA marker; 图2 HPV18E7蛋白的SDS-PAGE电泳及 Western Blot分析； 图2中，M: marker; 1-3?重组质粒pET21a( + )/HPV18E7 分别经IPTG诱导9h、6h、3h蛋 白表达;4?重组质粒pET21a( + )/HPV18E7未经IPTG诱导蛋白表达;5. E.coli. BL21 (DE3) 菌株。A:SDS_PAGE;B: Western Blotting分析（一抗为小鼠抗6 X His单克隆抗体（1: 5000))； 图3 Elisa检测三级库单克隆的亲和性的数据图； 图4选择进行研究的3个克隆氨基酸序列； 图5A pET21a( + )/Z hpvi8 E7的重组质粒构建示意图； 图5B重组质粒pET21a( + )/Z hpvi8E7酶切鉴定图； 图5B中，Ml: DL2000 DNA marker; 1: Z HPV18 E7 DNA片段2: pET21a( + )/Z hpvi8E7/ Ndel+EcoRI; 3: pET21a( + )/ZHpvi8E7重组质粒；4: pET21a( + )质粒；M2:. lkbDNA marker； 图6A重组蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的表达； 图6A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重组质粒pET21a( + )/Z HPV18E7诱导前；3. pET21a( + )/Z HPV18E7:228重组蛋白；4. pET21a( + )/Z HPV18E7:242重组蛋白；5 .pET21a( + )/ZHPvi8E7:3i。重组蛋白；6. SPAZ蛋白； 图6B重组蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的纯化图； 图6B中，M: marker;;l.纯化后pET21a( + )/Z hpvi8E7:228蛋白；2.纯化后pET21a( + )/Z HPV18E7:242蛋白；3.纯化后pET21a( + )/Z HPV18E7:310蛋白；4.纯化后Zwt蛋白； 图7 Z Hm8E7与HPV18 E7亲和力的表面等离子共振鉴定； 图7A:不同浓度Z HPV18E7:228获得的传感；图7B:不同浓度Z HPV18E7:242获得的传感；图 7C:不同浓度 Z HPV18E7:31Q 获得的传感；图 7D: Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 及其 SPA-Z对照蛋白与HPV18 E7结合的表面等离子共振比较； 图8 Z HPV18E7与HPV18 E7天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光方法鉴定(共聚焦激光显微 镜 X400); 图8A:Z HPV18E7:228蛋白的间接细胞免疫焚光检测；图8B:Z HPV18E7:242蛋白的间接细胞 免疫荧光检测；图8C: Z Hm8E7:31Q蛋白的间接细胞免疫荧光检测； 图9 HeLa细胞各数量组接种裸鼠移植瘤生长曲线； 图10 HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤组织HE染色切片观察（X 400); A:4xl07/ ml HeLa细胞组；B:lxl07/ ml HeLa细胞组；C:lxl06/ ml HeLa细胞组； 图11正常裸鼠注射dy_ZHPV18 E7:228后生物近红外信号分布图 A:正常裸鼠注射dy-ZHPV18E7:228后各时间段的生物近红外信号成像图；B:正常裸鼠注 射dy-ZHPV18 E7:228后各时间段的肾脏与正常组织近红外信号强度的比值图。
[0025] 图 12 HeLa荷瘤鼠注射dylight标记的ZHPV18 E7:228，ZHPV18 E7:31Q，ZhPV18 E7:242，ZWT后生 物焚光分布图； 图13 HeLa荷瘤鼠注射dylight标记的ZHPV18E7 affibody后肿瘤和肾脏的生物分布曲 线。A，B，C，D分别为HeLa荷瘤鼠注射Dy755-Z HPV18 E7： 228 ； Dy755~Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7:224;Dy755_Zwt后各时间段肿瘤、左肾和右肾与正常组织的焚光强度比值。E为各时间 段HeLa荷瘤鼠注射Dy755-z HPV18 E7：228 ；Dy755-Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7：224 ；Dy755-Zwt 后各时间段肿瘤与正常组织的荧光强度比值。
[0026] 图 14 pET21a( + )/Z HPV18 E7/PE38KDEL的重组质粒构建示意图； 图15重组质粒pET21a( + )/Z HPV18E7/PE38KDEL酶切鉴定图； 图 15中，Ml: DLlOOOOBp Marker; 1: pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL质粒2: pET21a( + )/228/PE38KDEL质粒；3: pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL/NdeI+EcoRI;4: Z hpvi8E7:228 DNA片段；M2:DL2000 DNA marker; 图 16 Zhpvis E7 affitoxin蛋白SDS-PAGE电泳和WB鉴定。
[0027] 图 16A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重组质粒pET21a( + )/Z hpvi8E7:228/PE38KDEL诱导前；3?重组质粒pET21a( + )/ Z hpvi8E7:228/PE38KDEL诱导后；4. pET21a( + )/Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL诱导后；图 16B 重组蛋白ZHpvi8E7affitoxin的纯化 M: marker; 1 ?纯化后affitoxin 228蛋白；2.纯化后affitoxin 310蛋白；图 16C, -抗为his-tag鼠单克隆抗体：1?纯化后affitoxin 228蛋白；2.纯化后affitoxin 310蛋白； 图 17 affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)对HeLa细胞的IC50分析； 图18不同浓度affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)蛋白对HeLa细胞的生长抑 制作用； 图19 Zhpvi8E7 affitoxin对HeLa细胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用效应； 图19中，三组裸鼠在接种HeLa细胞后，待肿瘤长至100~200 mm3大小时，尾静脉注射 5mg/kg affitoxin228蛋白或affitoxin 310蛋白及0.2 ml PBS，每隔3天注射一次，共6次， 图中箭头所示； 图20 ZHPV18 E7 affitoxin对HeLa细胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用； 图20中，A为45天后处死各组裸鼠所剥离的肿瘤组织;B为各组所剥离肿瘤组织的平均 重量。
【具体实施方式】
[0028]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不 能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明 作出一些非本质的改进和调整。
[0029]如本文所用，所述的"对HPV18 E7具有结合亲和力的多肽"是指以葡萄球菌A蛋白 Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异 性结合HPV18 E7、具有极少或没有非特异性结合。
[0030]如本文所用，所述的"本发明的多肽"、"对HPV18 E7具有结合亲和力的多肽"、 "HPV18E7 结合多肽"、"Zhpvi8E7 affibody 多肽"、"Zhpvi8E7 afTibody"、"ZHPVi8E7''、"afTibody 蛋白"、"affibody重组蛋白"、"Zhpvis E7重组蛋白"可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使 用。
[0031]如本文所用，所述的"靶向性分子"是指将本发明的对HPV18 E7具有结合亲和力 的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向HPV18E7的分子。所述的偶联物可以 是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒18型的药物，酶或可检测标记物等。
[0032]如本文所用，所述的"融合多肽"是所述的"靶向性分子"的下位概念，是指本发明 的对HPV18 E7具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段） 连接后获得的、可以靶向HPV18 E7的分子。
[0033]本发明人选择HPV18 E7作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域 (Zwt，SEQ ID NO: 1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通 过噬菌体展示技术构建突变文库，以HPV18 E7作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大 量的筛选工作，最终获得了对于HPV18 E7具有高度亲和力的多肽。
[0034]本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个 (较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于 葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID N0: 1)，在第9-11，13-14，17-18,24-25,27_ 28,32,35,43位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO: 1-4任一所 示的氨基酸序列，如表1所示。
[0035]本发明还涵盖了在所述HPV18 E7结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额 外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HPV18 E7时起作 用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几 种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如 在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外 的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个"标记"，如与标记抗体相互作用的六 组氨酸肽(His6)标记，或"myc"标记或"flag"标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代 方式也包含在本发明中。
[0036]所述"额外的氨基酸残基"也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与 第一个、HPV18E7结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或 是一种荧光功能，或是其组合。
[0037]本发明也包含在所述的HPV18 E7结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条 件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在 没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频 繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲 和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
[0038]本发明也包含在本发明的HPV18 E7结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多 肽。这些修饰(通常不改变一级结构）形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰 化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行 糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨 酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化 了溶解性能的多肽。
[0039]本发明的HPV18 E7结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子， 这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附;所述的化学键是共价键或非共价键。作为 一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的HPV18 E7结合多肽与偶联物之 间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨 基酸;较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较 佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用 于本发明。
[0040] 在"异源"融合多肽中，所述HPV18 E7结合多肽构成了第一个结构域或第一个部 分，第二和其它部分具有除了结合HPV18 E7外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明 的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了HPV18 E7外的其它靶分子具有 亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置 具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个HPV18 E7结合结构域和至少一个与所述其它 靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、 检测或分离试剂。
[0041] 本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部 分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。 作为本发明的优选实施方式，将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL通过柔性肽连接于 HPV18 E7结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶 (例如羧肽酶）而进行"ADEPT〃（抗体介导的酶前药治疗，anti body-directed enzyme prodrug therapy)的酶;包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细 胞因子，如11^-2、1?1^、11-12、了陬€[、1?10 ;包括促凝血因子，如组织因子、￥011啊11613抑11(1 因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如 auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如68Ga、76Br、 mIn、99Tc 、124I、125I)用于诊断或放射性核素(如9()Y、131I、 211At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的 氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸），其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽 序列。
[0042]本发明还涵盖了在所述的HPV18 E7结合多肽上连接一个可检测标记物（如荧光 标记，生物素或放射性同位素），从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测HPV18感染或 HPV18感染相关疾病的目的。
[0043] "HPV18 E7结合亲和力"是指可以例如通过利用表面等离子共振 (surfaceplasmon resonance)技术如Biocore?装置进行检测的一种多肽特性。HPV18 E7 结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将HPV18 E7固定在该装置的感应芯片上，然 后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应 芯片上，然后将含有HPV18 E7的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应 图像建立多肽的HPV18 E7结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法， 例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可 以利用Biocore?2000装置(Biocore AB)进行测定。HPV18 E7固定于该装置的感应芯片 上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果 中计算KD值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到1X1(T 6M至3X1(T7M。
[0044] 本发明还提供了编码本发明的HPV18 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分 离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别 获得。
[0045] 本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸 分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，"操作 性相连"或"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线 性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作 地连于编码序列。
[0046] 在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳 动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体:实验室手册中所描述的。
[0047] 此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语"宿主细胞"包括原 核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等;例如可为大肠杆菌细 胞(E. co 1 i)，如大肠杆菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细胞。
[0048]生产本发明的HPV18 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本 发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述 制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
[0049] 基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内 容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用 作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达 载体。
[0050] 当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多 肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍 生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
[0051]本发明还涉及所述的HPV18 E7结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的 应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
[0052]本发明的HPV18 E7结合多肽可作为HPV18 E7抗体在不同应用中的一种替代物。 [0053]作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以HPV18 E7表达或HPV18感染为特征 的疾病，例如肿瘤(如宫颈癌，头颈部肿瘤)等。通过结合胞内HPV18 E7以抑制细胞信号传 导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或 者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向HPV18 E7蛋白 的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物 传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范 围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。
[0054]在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨 基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明 还涵盖了保留了结合HPV18 E7能力的该多肽的片段。
[0055]本发明的HPV18 E7结合多肽可以作为治疗制剂，其治疗作用基于至少一种以下 机制：（i)加强化疗作用，施用本发明的多肽与目前和将来的化疗治疗协同作用。阻断胞内 的HPV18 E7蛋白对抑癌基因pRb的破坏作用；（ii)抑制肿瘤细胞的增殖。可能在细胞内 存在以下机制：当结合多肽进入细胞内部与HPV18 E7蛋白结合时，阻断了HPV18 E7与pRb 的结合，从而阻断了细胞生长增殖信号。
[0056]本发明多肽的HPV18 E7结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白） 和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位， 这些肿瘤包括表达HPV18 E7的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的HPV18 E7结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达HPV18 E7 的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。
[0057]这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到HPV18 E7结合多肽上 的蛋白质，如选自用于"ADEPT"（antibody_directed enzyme prodrug therapy)应用的效 应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL_2、IFNy、IL-12、 TNFaa、IP 10等;促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等;毒素，如蓖麻毒蛋白 A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞 毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如 9()Y、131I、211At等），这种同位 素可与HPV18 E7结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂D0TA或DTPA而 与HPV18 E7结合多肽结合。
[0058]在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达 HPV18E7细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与与HPV18 E7结合多肽 的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。
[0059]本发明还包括使用所述的与HPV18 E7结合的多肽检测样品中的HPV18 E7蛋白。 [0060] 例如，这种检测可以用来诊断特征为表达HPV18 E7的疾病情况。检测HPV18 E7 的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄 影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针 对与HPV18 E7的抗体，这种方法可以适用于本发明的与HPV18 E7结合多肽，这种方法是 组织化学方法检测与HPV18 E7的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的 组织样品中与HPV18 E7蛋白的表达。为了检测HPV18 E7， 本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者， 其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适 的放射性同位素包括68Ga、 76 Br、mIn、99Tc、124I和1251等。
[0061]本发明还包括将所述的HPV18 E7结合多肽应用于检测生物学液体样品中 HPV18E7。这个方法包括以下步骤：（1)提供被检测患者的生物学液体样品，（2)将本文所述 的HPV18 E7结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何HPV18 E7结合的条件下加入 样品中，（3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品 中存在的HPV18 E7量相关。在步骤(2)中，HPV18 E7结合多肽可以以任何适宜的形式加入 到样品中，包括例如这样的情况，当HPV18 E7结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过 其使样品接触，或HPV18 E7结合多肽存在于溶液中。
[0062]所述的HPV18 E7结合多肽的其它应用还包括:检测样品中HPV18 E7的方法，包 括如下步骤：（1)提供一种怀疑含有HPV18 E7的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包 埋的组织切片，（2)在适宜条件下加入本发明的HPV18 E7结合多肽到所述样品中，所述条 件为益于所述多肽与样品中存在的任何HPV18 E7结合，（3)除去未结合的多肽，及(4)检测 结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV18 E7的量相关。
[0063]本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV18 E7表达的试剂盒，包括与报告酶(如 碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的HPV18 E7结合多肽、检测酶活性的试剂、 和阳性和阴性对照组织切片。
[0064]本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV18 E7表达的试剂盒，包括通过抗体检 测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的HPV18 E7结合多肽、一个特异于标 记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织 切片。
[0065]诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行 这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的HPV18 E7结合多肽、一 种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是6心、7如、11111!、 991'(3、1241和1251等），以及用于 分析掺入效率的试剂。
[0066]如上所述，本发明涵盖了本发明的HPV18 E7结合多肽将活性物质靶向表达HPV18 E7的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试 剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的HPV18 E7结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非 限制性的例子是，、1311、21^)，以及用于分析掺入效率的试剂。
[0067] 本发明还提供一种药物组合物，其包含:有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒 18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子，和药学上 可接受的载体。
[0068] 如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上可接受的载体"指用于 治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不 是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知 的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于 药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐 水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂 或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
[0069] 可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限 于:注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
[0070] 在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有 结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人），其中该安全有效量通常至少约1 微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微 克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因 素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0071] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0072] (1) HPV18 E7蛋白的制备：以实验室保存的pET32a( + )/HPV18 E7重组质粒转化 E. co 1 i BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳，一明显蛋白条带出现在相对分子质 量(Mr)约20kDa的位置，与预期蛋白Mr大小相符（图5A)。经用亲和层析柱析纯化后，经SDS-PAGE分析在Mr20kDa的位置处出现1条较为单一的的蛋白条带（图2A)。以小鼠抗6XHis mAb为一抗进行Western blot分析，可见在Mr 20kDa处出现信号反应带（图2 B)，说明此条 带为HPV18 E7蛋白，其纯化后条带较单一。
[0073] (2)利用制备的HPV18 E7蛋白对实验室保存的噬菌体随机affibody文库进行淘 洗：以HPV18 E7蛋白为靶蛋白，用噬菌体随机affibody文库进行四轮淘洗;将纯化的HPV18 E7蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库（初级库）孵育、再加入E. coli TG1 37 °C，轻摇温育；取100yl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100yl涂布S0B-AG平 板，30°C过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算HPV18E7结合噬菌体滴度;结果平板可见 菌落，滴度是1X10 2;此时完成第一轮淘洗，另部分菌液加101()辅助噬菌体M13K07(购自北京 宝科维食安生物公司）和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经〇. 22mi滤膜过滤，获得HPV18 E7分子亲和筛选后的噬菌体文库，为一级affibody库。重复上述3轮富集筛选，分别获得 HPV18 E7分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度为IX 106;在二级库的基础上再重复 上述2轮富集筛选，为三级文库，滴度为1 X 108，同法获得四级文库，滴度为2 X 108。同时设置 不加噬菌体的空白对照作同步筛选。
[0074] (3)筛选与HPV18 E7蛋白特异性结合的高亲和性的亲和体affibody，标为ZHm8E7: 随机挑取四轮淘洗后的affibody单克隆，用ELISA、测序等方法选取affibody分子，即 ZHPV18E7;挑取第四轮淘洗后的HPV18E7亲和体四级库的235株单克隆进一步进行Elisa验证， 根据0D450值读数，选取0D450值读数较高的80株克隆，即读数高于0.6(0D450>0.6)，送往 测序(如图3)。经过测序鉴定，10个克隆序列完全正确，且翻译后没有终止子。从中选取3个 亲和力较高的单克隆，它们是228、242、310克隆，进行后续的研究，这三个单克隆分别标记 为Z HPV18 E7:228、Z HPV18 E7:242、Z HPV18 E7:31Q(氨基酸序列如表1，亦可参见附图4,核苷酸序列参 见附图4)。
(4)制备ZHPV18E7蛋白，并鉴定其与HPV18 E7蛋白的亲和性： 将筛选得到的affibody阳性克隆ZHPV18E7克隆入载体pET21a( + )，构建成重组质粒 pET2 la ( + )/ZHPV18E7，表达、纯化ZHPV18E7蛋白；培养宫颈癌HeLa细胞株，利用细胞免疫荧光和表 面等离子体谐振(SPR)技术鉴定Z HPV18E7蛋白与HPV18 E7蛋白的亲和性和特异性;具体为： ①pET21a( + )/Z HPV18 E7的重组质粒构建 以筛选得到的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q克隆为模板，经PCR扩增，利用Ndel 和EcoRI酶切位点作为插入载体位点，克隆入pET21a( + )载体构建重组质粒（图5A);构建的 pET21a( + )/Z HPV18 E7重组质粒经Ndel和EcoRI酶切后，酶切产物在琼脂糖凝胶电泳中约5400 bp和174 bp处各出现一条单一条带（图5B)，和pET21a( + )/Z HPV18 E7的理论大小相符。经测 序，用NTI软件匹配重组质粒序列和理论序列，两者吻合，说明重组质粒构建成功（图6)。 [0076] ②pET21a( + )/Z HPV18 E7重组蛋白表达、鉴定及纯化 pET21a( + )/Z HPV18 E7重组质粒在E.coli BL21(DE3)中经IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE 电泳鉴定，在相对分子质量(Mr)约7kDa的位置，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7： 310§|5 lH 现明显的蛋白条带，与本实验室原先构建的野生型affibody蛋白，SPAZ(Zwt)蛋白，相吻合 (图7A)。由于重组质粒pET21a( + )/Z HPV18 E7的C端含有pET21a( + )上的His标签，所以用亲和 层析柱析纯化后，经 SDS-PAGE 分析，Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 蛋白在约 7kDa 的 位置处出现1条较为单一的蛋白条带，与对照蛋白SPAZ蛋白相一致（图7B)，说明Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7: 310蛋白成功表达并制备了纯化蛋白。
[0077] 本实施例中，本发明选择pET21a( + )载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位 点为Ndel ( CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用 原核表达系统表达的蛋白即为全长的目的蛋白Affibody而不带载体蛋白片段，避免了载体 蛋白对实验结果的干扰，为后续试验打下了良好的基础。将筛选出的亲和体分子Z HPV18E7构 建在pET21a(+)载体上，在原核中表达相应蛋白，利用载体自身的His标签可以将重组蛋白 通过N i亲和层系柱纯化方法纯化得出较高纯度的重组蛋白，经S D S - P A G E电泳鉴定， ZhPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:310表达蛋白大小在约7.8 kDa的位置。由于affibody分 子量小，可以穿透0.2WI1的PVDF膜，故无法对其进行Western Blot进一步分析。本实施例采 用下列表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR)和免疫焚光等方法对其在蛋 白水平和细胞水平与靶蛋白的亲和特性进行进一步的验证。
[0078] ③表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR)技术分析和鉴定 将所用的革巴蛋白HPV 18E7和未和体Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白以及用 作对照的野生型SPAZ(Zwt)蛋白表达、纯化、浓缩和复性后备用，调节蛋白浓度至500ug/ml。 根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将HPV18E7重组蛋白固定，进行与筛 选多肽之间的亲和力测定。第6个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。将Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7：310> SPAZ蛋白稀释成不同浓度，依次通过芯片表面。所有的 分析在25°C进行，流速为30yl /min，注射标本的容量为200yl，并以流速30yl /min随机顺 序注射，随后用HC1(BI0-RAD 货号:#176-2250 100 mM HC1)洗涤6min(解离），利用ProteOn Manager?软件(BI0-RAD)的1: 1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图）。
[0079] 从图9可知，Z HPV18 E7:228浓度范围从0到20nM，最低0.625nM，Z HPV18 E7: 242浓度范围 从0到40nM，最低1.25nM，Z HPV18 E7:31Q浓度范围从0到20nM，最低0.625nM。从这些结果可知， 这三个亲和体分子均与靶蛋白有结合，然而，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 310 的最低浓度更低，说 明它们和靶蛋白的结合更强。将不同亲和体蛋白用解离平衡常数(KD)进行动力学分析，发 现在同一蛋白浓度水平时，Z HPV18 E7:228的解离平衡常数最高，Z HPV18 E7:31Q的解离平衡常数 次之，Z Hm8E7:242的解离平衡常数最低，而对照蛋白SPAZ的数值低于0,说明SPA Z与靶蛋白 HPV 18E7没有结合。
[0080]由此可知，筛选出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特异性识别 HPV 18E7蛋白，从蛋白水平验证了筛选出的三个重组Affibody蛋白与细胞表达的HPV 18E7 具有很强的亲和力。
[0081 ]④细胞免疫荧光分析和鉴定 用纯化的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白孵育HPV18E7蛋白表达阳性的宫颈 癌HeLa细胞，6小时后，分别用His单克隆抗体、SPA-Z兔血清以分析Z HPV18 E7蛋白与细胞株表 达的HPV 18E7蛋白的识别和结合能力，与此同时设置HPV 18E7蛋白表达阴性但HPV 16E7蛋白 表达阳性的Siha细胞株进行对比。在共聚焦荧光显微镜下观察到，HeLa细胞的细胞核内可 见多个绿色的点状或团块状焚光蛋白，而Siha细胞却未见明显的焚光，并且三个Z hpvi8 E7蛋 白在HeLa细胞的细胞核均可见绿色的点状或团块状荧光，如图8所见。
[0082] 本实施例中HeLa细胞为HPV 18DNA阳性细胞，而Siha则为HPV 18DNA阴性但 HPV16DNA阳性的宫颈癌细胞，在本研究的细胞免疫荧光实验中，筛选出的三个ZHPV18 E7蛋白 在HeLa细胞中均能检测出，而Siha细胞中均未检测出，表明本研究筛选获得的Z HPV18 E7:228、 Z HPV18 E7：242 >Z HPV18 E7： 31〇特异性识别能力强，均能与HPV18E7发生特异性结合，但不识别 HPV16E7蛋白。
[0083]由此可知，筛选出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特异性识别细 胞中天然表达的HPV 18E7蛋白，从细胞水平验证了筛选出的三个重组Affibody蛋白与细胞 表达的HPV 18E7具有特异性结合的亲和力。
[0084] [5]在宫颈癌细胞荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性 在本实施例的实验中，选择筛选的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白作为检测 对象，用近红外荧光染料DyLight755 NHS EsteKThermo Fisher公司，美国，货号62278)标 记上述蛋白，并将其注射到携带宫颈癌HeLa细胞移植肿瘤的小鼠体内，进行Z HPV18E7 af f ibody的生物分布研究，并对裸小鼠成像定位以研究标记蛋白的祀向特性，同时用Zwt蛋 白作对照。
[0085] 具体为： ①宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 分别将11106/1111，111〇71111，41107/1111三种不同浓度的宫颈癌拖1^细胞悬液和?83各 0.2ml皮下接种4-5周龄雌性裸鼠，接种后21天左右，实验组裸鼠接种部位开始出现粟粒大 小结节，瘤体增长速度与细胞量相关，4xl07/ ml组瘤体增长最快，lxl07/ml组瘤体增长次 之，两组裸鼠均在接种后第30天结节直径增至300mm 3以上，且随时间推移瘤体逐渐增大，而 lxl06/ml组裸鼠在接种后第30天也出现300mm 3以上的瘤体，但随着时间推移瘤体没有显著 增大，对照组PBS组全程没有结节生长（见图10)。全程观察期间，裸鼠没有死亡，精神状态 可，反应灵敏，饮食正常。接种HeLa细胞悬液60天后，处死荷瘤鼠，解剖观察肝、脾、肾、大网 膜、子宫附件等脏器，未见明显变化，无转移。将肿瘤组织制成石蜡切片，进行病理学观察， 使用HE染色，结果显示各实验组均见大小形状不一的细胞、核仁肥大、深染细胞核、胞浆丰 富(见图11)。
[0086] ② DyLight-755 NHS Ester标记Z hpvi8 E7蛋白的鉴定 按DyLight-755试剂说明书进行操作和鉴定。即将标记后的重组蛋白Dy755- Z HPV18 E7:228用16%聚丙烯酰胺凝胶遮光电泳，切取合适大小的凝胶放于活体成像仪中，激发光 滤片为671-705nm，发射光滤片为7501ongpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波长间 隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，用Maesro自带的软件进行图像处理及分析。结果重 组蛋白Dy755- Z Hm8E7:228泳道有激发光，出现单一的荧光条带，表明重组蛋白Dy755- Z HPV18 〇
[0087] ③Dy755_ Z hpvi8 E7在正常裸鼠体内的生物分布 为分析Dy755- Z即^^在正常裸鼠体内的代谢，用10%水合氯醛腹腔注射诱导麻醉， 待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50yg Dy755- Z HPV18E7:228蛋白，置于小动物活体成 像仪（CRi Maesro 2.10, in-vivo fluorescence imaging system)中成像，并用0.8-1 .On 1/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、 2 h、4 h、6 h、8 h和24h连续成像观察。结果可见双侧肾脏出现了最大的荧光信号，将其与 腿部肌肉处的荧光信号比值进行分析，即肾脏/正常组织率(K/N ratio=[肾脏R0I的背景 信号/正常R0I的组织(肌肉）背景信号]X100%}。结果表明，Dy755- Z HPV18E7:228主要分 布于肾脏，在注射后肾脏的荧光信号逐渐增强，并于2-4小时达到高峰，此后逐渐减弱，并于 72小时焚光信号完全消失。表明，Dy755- Z hpvi8 E7的蛋白主要分布于正常裸鼠的肾脏，即经 肾脏排泄，并于72小时内完全排泄（图13A，B)。
[0088] ④Dy755_ Z hpvi8 E7在HeLa细胞荷瘤裸鼠体内的生物分布 待裸鼠的HeLa肿瘤长至300-500mm3时将裸鼠带出SPF屏障系统，用10%水合氯醛腹腔注 射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50yg Dy755- ZHPV18E7:228、Dy755- Z HPV18E7:242、Dy755- Z HPV18E7:31Q及对照Dy755- Zwt蛋白，置于小动物活体成像仪（CRi Maesro 2.10m)中成像，并用0.8-1.0iil/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程 中处于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、2 h、4 h、6 h、8 h和24h连续成像观察。观察发现， Dy755_ Z HPV18 E7:228、Dy755_ Z HPV18 E7:242、Dy755_ Z HPV18 E7:310蛋白尾静脉注射5分钟内近 红外信号分布全身，然后逐步向肿瘤和双肾聚集，1小时左右，肿瘤部位和双肾部位信号明 显增强，肿瘤近红外信号至4-6小时达到高峰，至24小时，双肾和肿瘤部位信号明显减弱；而 对照Dy755- Zwt，则肿瘤部位在观察的各时间段均没有显著增强的信号出现。肿瘤与正常组 织的近红外信号比值与上述观察的结果相一致，也是以4-6小时比值达到高峰。荷瘤小鼠在 观察期间状态良好，未见明显毒性反应。
[0089] 本实施例结果表明，Dylight755标记的Dy755_ Z HPV18 E7: 228、Dy 755- Z HPV18 E7:242、Dy755- Z HPV18 E7:31Q均具有靶向结合HPV18E7表达阳性肿瘤的特性，且没有严重 的毒副作用。为HPV18阳性的宫颈癌靶向治疗和分子显像提供可能。
[0090]
[6]Z hpvi8E7 affitoxin体外对宫颈癌细胞生长抑制作用： 在本实施例的实验中，利用Z HPV18E7的靶向作用，携带经改构具有细胞毒作用的绿脓杆 菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作为细胞毒分子。构建 affibody/PE38KDEL原核表达载体，并利用原核表达系统制备并纯化了 affibody/PE38KDEL 蛋白，即affitoxiruaffitoxin对宫颈癌细胞的体外生长的抑制作用进行验证。
[0091 ] 1)选择Z HPV18E7:228和Z HPV18E7:31Q作为研究对象，利用分子克隆技术构建分别构建 pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL 和 pET21a( + )/ZHPvi8E7:3io/PE38KDEL 重组质粒；并测序鉴定。 [0092] 2)制备原核表达重组免疫毒素 Zhpvi8E7: 22 8/PE38KDEL和 Zhpvi8E7: 3io/PE38KDEL， affitoxin 228和affitoxin 310蛋白，BPaffitoxin 228和affitoxin 310蛋白，分别经 SDS-PAGE及Western blot分析鉴定； 3)为研究Z Hm8E7affitoxin228,310多肽体外细胞生长是否具有抑制作用，选择HeLa 肿瘤细胞株作为实验对象。利用CCK-8试剂检测affitoxin 228和affitoxin 310蛋白对细 胞生长过程中各时间点的细胞生存率进行检测，并利用Grahpad primer5.0软件计算Z HPV16E7affibody 多肽的 IC50。
[0093] 具体为： ① pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重组质粒的构建 以pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228和Zhpvi8E7:31q质粒为模板，经PCR扩增，利用Ndel和EcoRI进 行双酶切，同时对实验室原先构建保存的pET21a( + )/Z HPV18 e7:228/PE38KDEL质粒双酶切，进 而酶连，构建成pET21a( + )/Z hpvi8 e7:22s/PE38KDEL重组质粒（图14);构建的重组质粒经Ndel 和Ecrol酶切后，酶切产物在琼脂糖凝胶电泳中6100 bp和174 bp处均出现单一条带，与 pET21a( + ) /PE38KDEL和Z hpvi8 E7:228的理论序列大小相吻合（图15)，说明本重组质粒构建 成功。
[0094] ②pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重组质粒的原核表达、鉴定及纯化 pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL及pET21a( + ) / Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL重组质粒 在E.coli BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE电泳鉴定，在相对分子质量(Mr)约 46kDa的位置出现一明显条带，与预期理论值大小相符，（图16A)。由于重组Z hpvi8 E7:3io/ PE38KDEL蛋白（即Z HPV18 E? affitoxin)的C端含有His标签，所以用亲和层析柱析纯化后，经 SDS-PAGE分析affitoxin228和310蛋白在约46kDa的位置处出现1条较为单一的蛋白条带 (图16B)。进一步通过Western Blot分析鉴定，结果（图16C)显示，His-tag鼠单抗作为一 抗，在分子质量约为46kDa均处出现单一条带，提示ZHPvi8E7affitoxin228、310重组蛋白能 特异性识别His-tag血清抗体。表明，2[^18￡73€打1：(?;[11228、310重组纯化蛋白制备成功。
[0095] ③为研究Z hpvi8E7 affitoxin体外细胞生长抑制作用，选择affitoxin228,310蛋白 作为研究对象，并选择HeLa肿瘤细胞株作为靶细胞。制备细胞悬液并计数接种于96孔细胞 培养板，0.5X 104 /孔。培养24h后，加入lμg/ml放线菌酮及5%胎牛血清，然后加入 affitoxin228，310蛋白，设置200iig/ml、100 μg/ml、50 iig/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml 六个浓度组，同时设培养基对照，采用CCK-8试剂盒检测细胞的生存率，在加样后72h，加入 CCK-8试剂10yl/孔，在C02培养箱内继续孵育30min后置于酶标仪A450处读数。每组均设置3 个复孔，并进行3次重复实验。细胞存活(Cell viability)计算方法为:Cell viability (% ) = (affitoxin组的0D值-培养基组0D值)/(培养基组对照组0D值-空白0D值）X 100% ; 同时用GraphPad primer 5.0软件来计算细胞生长存活的IC50值。
[0096] 结果如图17,经GraphPad primer 5.0软件来计算HeLa细胞生长存活的IC50值， affitoxin228, 310蛋白的 IC50分别为0? llMm (图 17A)和0.05福（图 17B)。图 18 显示， affitoxin 228和310蛋白对表达HPV18 E7阳性的宫颈癌细胞HeLa具有较强的杀伤作用， 作用72h后，其细胞生存率随着剂量浓度的升高而下降，具有剂量依赖性。afTit 〇xin228， 310蛋白的六个剂量组之间（200iig/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml)， 200μg/ml与100 μg/ml剂量组之间对HeLa细胞生长率均有显著性差异无显著性差异(p> 0.05)，但200μg/ml及100 μg/ml与其他剂量组对HeLa细胞生长率均有显著性差异（p〈 0.05)〇
[0097] 以上结果表明，affitoxin 228，310具有体外HPV18E7靶向抑制细胞生长的特异 性。
[0098] [7]研究ZHPV18E7 affitoxin 228，310对宫颈癌细胞荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用： 为研究Z HPV18E7 affitoxin228,310蛋白体内对荷瘤裸鼠的抑瘤作用，将宫颈癌细胞株 HeLa细胞数调整至lX107/ml，接种于4-5周龄的裸鼠背侧近右前肢处，每只0.2ml，待肿瘤生 长100~200 mm3大小时，分成3个组别，SPaffitoxin 228蛋白，affitoxin 310蛋白及PBS对 照组，蛋白按照5mg/kg的剂量，每只裸鼠经尾静脉注射0.2ml对应样品。每3天注射1次，共6 次。同时每3天观察小鼠生活和精神状态等，测量肿瘤大小并拍照记录，观察至45天。之后处 死小鼠剥离肿瘤组织，称重肿瘤大小。从图19可知，各组裸鼠在注射蛋白后，随着时间的推 移，PBS组瘤体逐渐加大，且增幅明显，在第33天瘤体即大于1000mm 3，而注射aff i toxin 228 蛋白和affitoxin 310蛋白6次后，affitoxin 228蛋白和affitoxin 310蛋白组的瘤体增长 缓慢，观察期间瘤体一直小于300mm3直至45天。45天全程观察期间，裸鼠反应可，饮食正常， 体重变化不明显。之后处死裸鼠，剥离的肿瘤组织拍照（图20A)并称量，affitoxin 228蛋白 和aff itoxin 310组瘤体最小，平均重量分别为0.16 ±0.05g和0.29±0.04g，而PBS组肿瘤 重量达到0.92±0.08g，经t检验，aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310组瘤体与PBS组比 较，差别有统计学意义(P〈〇.5)(如图20B)，而aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310组比较 差别有统计学意义(P>〇. 5)。
[0099] 上述结果表明，affitoxin228和affitoxin310蛋白均具有HPV18 E7靶向抑瘤作 用。且毒副作用不明显。
【主权项】
1. 一种对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于:该多肽 是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽。2. 如权利要求1所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特 征在于:相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，该多肽在第9-11，13-14，17-18,24-25， 27-28,32,35,43位上发生氨基酸突变。3. 如权利要求2所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特 征在于，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，该多肽的： 第9位氨基酸突变为P、F或A; 第10位氨基酸突变为F、L或V; 第11位氨基酸突变为C、L或R; 第13位氨基酸突变为R、M或S; 第14位氨基酸突变为Q、V或G; 第17位氨基酸突变为S、F或A; 第18位氨基酸突变为P、W或V; 第24位氨基酸突变为H、E或P; 第25位氨基酸突变为Η或E; 第27位氨基酸突变为Ε、Α或D; 第28位氨基酸突变为P、E或L; 第32位氨基酸突变为G、R或P; 第35位氨基酸突变为P、H、Q或V; 第43位氨基酸突变为E、D或K。4. 如权利要求1所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，其特 征在于:该多肽与人乳头瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值为1X10_ 6M至3X10_7M。5. -种靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权 利要求1-4任一所述的多肽，以及与该多肽相连接(或偶联)的偶联物，所述的偶联物包括： 半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人乳头瘤病毒18型的药物，或可检测标记物。6. 如权利要求5所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑 制人乳头瘤病毒18型的药物包括:毒素;所述毒素是具有抑制人乳头瘤病毒18型病毒感 染或抑制肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述毒素的功能性片 段;且所述的肿瘤是人乳头瘤病毒18型阳性的肿瘤。7. -种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4任一所述的对人乳头瘤病毒18型的E7 蛋白具有结合亲和力的多肽。8. -种多核苷酸，其编码权利要求5或6所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分 子，且其中所述的偶联物是肽。9. 一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求7或8所述的多核苷酸。10. -种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求9所述的重组载体，或其包 含有或基因组中整合有权利要求7或8所述的多核苷酸。11. 一种制备权利要求1-4任一所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合 亲和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培养权利要求10所述的细胞，从而表达权利要求1-4任一所述的对人乳头瘤病 毒18型的E7蛋白具有结合未和力的多妝； (2) 分离纯化(1)获得的多肽。12. -种如权利要求1-4任一所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力 的多肽或如权利要求5或6所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制 备治疗人乳头瘤病毒18型感染疾病或人乳头瘤病毒18型表达阳性肿瘤的药物;或用于制 备检测人乳头瘤病毒18型病毒感染的检测试剂;或用于制备诊断人乳头瘤病毒18型感染 疾病或人乳头瘤病毒18型表达阳性肿瘤的诊断试剂。13. -种药物组合物，其特征在于，其包含： 权利要求1-4所述的对人乳头瘤病毒18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽或权利 要求5或6所述的靶向人乳头瘤病毒18型的靶向性分子;和药学上可接受的载体。14. 一种用于诊断或治疗人乳头瘤病毒18型感染疾病或人乳头瘤病毒18型表达阳性 肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括:权利要求1-4任一所述的对人乳头瘤病毒 18型的E7蛋白具有结合亲和力的多肽，或权利要求5或6所述的靶向人乳头瘤病毒18 型的靶向性分子，或权利要求13所述的药物组合物。
【文档编号】G01N33/574GK105820219SQ201610056286
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月27日
【发明人】张丽芳, 王乐丹, 薛向阳, 朱珊丽, 蒋朋飞, 李文姝, 陈俊
【申请人】温州医科大学