抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物耐碱性中的应用
【专利摘要】本发明公开了抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物耐碱性中的应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列1的第93-774位氨基酸的蛋白质；b)将序列表中序列1的第93-774位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质；c)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；d)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同蛋白功能的蛋白质。实验证明，本发明的抗逆相关蛋白及其编码基因可以用来应用于培育耐碱性的植物。
【专利说明】
抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物耐碱性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中抗逆相关蛋白及其编码基因在调控植物耐碱性中的 应用。
【背景技术】
[0002] 碱胁迫是我国农业生产中影响作物产量的重要因素。报道称目前我国存在盐碱化 的土地达到15亿亩，且每年都有大量土地因为耕作不善而退化为不适宜作物生长的盐碱 地，提高植物耐碱性对我国的粮食安全有重要意义。
[0003] 对于植物而言，pH环境会对植物根的生长发育造成影响；碱胁迫会显著影响植物 光合作用速率、光呼吸和营养吸收等，例如拟南芥在碱性环境下会造成Fv/Fm值降低。细胞 内各细胞器之间相互协调以稳定植物细胞的内环境，从而保证细胞内反应正常进行。同样 细胞内的生理活动也会影响根系的环境pH。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应 用。
[0006] 本发明所提供的抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述抗逆相关蛋 白，其名称为RAK1，是如下a)或b)或C)或d)的蛋白质：
[0007] a)氨基酸序列是序列表中序列1的第93-774位氨基酸的蛋白质；
[0008] b)将序列表中序列1的第93-774位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质；
[0009] c)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
[0010] d)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同蛋白功能的蛋白质。
[0011] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0012] 表1、标签的序列
[0013]
[0014]
[0015] 上述b)中的RAK1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述b)中的RAK1的编码基因可通过将序列表中序列2的第277-2325位核苷酸所示的DNA序 列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/ 或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/ 或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017] 其中，序列2由2325个核苷酸组成，编码序列1所示的氨基酸序列。序列2的第 277-2325位核苷酸编码序列1的第93-774位氨基酸所示的RAK1蛋白；序列2的第1-276 位核苷酸编码序列1的第1-92位氨基酸所示的MYC标签。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述RAK1相关的生物材料在调控植物 抗逆性中的应用。
[0019] 本发明所提供的与所述RAK1相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所 述与所述RAK1相关的生物材料，为下述C1)至C20)中的任一种：
[0020] C1)编码所述RAK1的核酸分子；
[0021] C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
[0022] C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
[0023] C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
[0024] C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
[0025] C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
[0026] C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
[0027] C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；
[0028] C9)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0029] C10)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0030] C11)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0031] C12)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0032] C13)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0033] C14)含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0034] C15)含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0035] C16)含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0036] C17)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0037] C18)含有C2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0038] C19)含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0039] C20)含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0040] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0041] 上述应用中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基 因：
[0042] 1)核苷酸序列是序列表中序列2的第277-2325位核苷酸的cDNA分子或DNA分 子；
[0043] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述RAK1的cDNA 分子或基因组DNA分子；
[0044] 3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述RAK1的cDNA分子或基 因组DNA分子；
[0045] 4)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
[0046] 5)与4)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为序 列1的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0047] 6)在严格条件下与4)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列1的蛋白 质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0048] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码RAK1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的RAK1的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码RAK1且具有RAK1功 能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0049] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码序列1的第93-774位氨基酸所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具 有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一 性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可 以用百分比（％ )表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0050] 上述应用中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗 膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 15min〇
[0051] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0052] 上述应用中，C2)所述的含有编码RAK1的核酸分子的表达盒（RAK1基因表达 盒），是指能够在宿主细胞中表达RAK1的DNA，该DNA不但可包括启动RAK1基因转录的 启动子，还可包括终止RAK1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序 列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启 动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子 35S :来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（〃LAP〃，Chao等人（1999)Plant Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2) 或LAP启动子（均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环 素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子 pF128 (CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特异的启动子（例如， 菜豆球蛋白、napin，oleosin 和大豆 beta conglycin 的启动子（Beachy 等人（1985)EMBO J. 4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参 考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（N0S 终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸 和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：0dell等人（I985)Nature 313:810 ;Rosenberg等人 (1987)Gene，56:125;Guerineau 等人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot(1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0053] 可用现有的表达载体构建含有所述RAK1基因表达盒的重组载体。所述植物 表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译 区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如 胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录 增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码 序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光 素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋 予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如 抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全 性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0054] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0055] 上述应用中，所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
[0056] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0057] 在本发明的一个实施方式中，RAK1的编码基因（即序列2所示的DNA分子）通过 含有RAK1的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌GV3101中。所述重组载体为用序列 2所示的DNA分子替换pCAMBIA1307的BamHI和Sail识别位点间的片段得到的重组载体 PCAMBIA1307-RAK1，所述pCAMBIA1307-RAKl表达氨基酸序列为序列1的蛋白质。
[0058] 上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为 十字花科植物。所述十字花科植物可为拟南芥。
[0059] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。
[0060] 本发明所提供的一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述 RAK1的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。
[0061] 在本发明的实施例中，所述RAK1的编码基因（即序列2所示的DNA分子）通过含 有RAK1基因表达盒的RAK1基因重组表达载体导入目的植物中。
[0062] 上述方法中，其中所述RAK1基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以 达到更好的表达效果：
[0063] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所 偏爱的密码子，在保持本发明所述RAK1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植 物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实 现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %、多于45 %、多于50 %或多于约 60% ；
[0064] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列进行修饰；
[0065] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0066] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发 明基因进行连接；
[0067] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序 列（例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0068] 在本发明的一个实施例中，RAK1基因重组表达载体具体为用序列2所示 的DNA分子替换pCAMBIA1307的BamHI和Sail识别位点间的片段得到的重组载体 pCAMBIA1307-RAKl，pCAMBIA1307-RAKl表达氨基酸序列为序列1的蛋白质。
[0069] 所述RAK1基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转 化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey，1998,Plant Molecular Biology (2nd Edition). )〇
[0070] 上述方法中，所述RAK1的编码基因的编码序列可为序列表中序列2。
[0071] 上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为 十字花科植物。所述十字花科植物可为拟南芥。
[0072] 上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第 一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常 规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植 物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0073] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述与所述RAK1相关的生物材料。
[0074] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述抗逆相关蛋白。
[0075] 本发明中，所述抗逆性可为耐碱性。所述碱性的pH可大于6. 3。所述pH可为 6. 3-8. 2。所述pH具体可为8. 2。
[0076] 实验证明，本发明的抗逆相关蛋白及其编码基因可以提高植物的耐碱性：在pH值 为8. 2的MS培养基上，0E-1的鲜重为rakl的2. 21倍，差异达到极显著水平；0E-1的鲜重 为Col-0的1. 07倍；0E-2的鲜重为rakl的2. 40倍，差异达到极显著水平；0E-2的鲜重 为Col-0的1. 16倍，差异达到显著水平。在pH值为8. 2的MS培养基上，0E-1的主根长为 rakl-的1. 69倍，差异达到显著水平；0E-1的主根长为Col-0的1. 24倍，差异达到显著水 平；0E-2的主根长为rakl的1. 85倍，差异达到显著水平；0E-2的主根长为Col-0的1. 36 倍，差异达到显著水平。实验证明，RAK1基因或其编码的蛋白RAK1可以提高植物的耐碱性， 可以用来应用于培育耐碱性的植物。
【附图说明】
[0077] 图1为半定量PCR检测rakl突变体中RAK1基因的表达水平。其中，A为半定量 PCR检测RAK1基因的表达水平；B为免疫杂交的方法检测rakl突变体中RAK1蛋白的表达 水平。
[0078] 图2为(：〇1-0、(^-1、(^-2、抑1^1的生长状况、鲜重和主根长以及狀1(1蛋白的表达。 其中，A为pH值为4. 8的MS培养基上Col-0、0E-1、0E-2、rakl的生长状况；B为pH值为 5. 8的MS培养基上Col-0、0E-1、0E-2、rakl的生长状况；C为pH值为8. 2的MS培养基上 Col-0、0E-1、0E-2、rakl的生长状况；D为pH值为4. 8、5. 8和8. 2的MS培养基上Col-0、 0E-1、0E-2、rakl 的鲜重；E 为 pH 值为 4. 8、5. 8 和 8. 2 的 MS 培养基上 Col-0、0E-1、0E-2、 抑让1的主根长丨为(：〇1-0、(^-1、(^-2、抑1^1中狀1(1蛋白的表达。
【具体实施方式】
[0079] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0080] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0081 ] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0082] 下述实施例中的pCAMBIA1307载体为Biovector产品，货号为Biovector-168625。
[0083] 下述实施例中的野生型拟南芥Col-0为SALK Institute产品。
[0084] 实施例1、抗逆相关蛋白RAK1基因的制备
[0085] 合成序列表中序列2的第277-2325位核苷酸所示的DNA分子（即抗逆相关蛋白 RAK1基因）。其中序列2的第277-2325位核苷酸编码氨基酸序列是序列表中序列1的第 93-774位氨基酸所示的RAK1蛋白（即抗逆相关蛋白RAK1);序列2的第1-276位核苷酸编 码序列1的第1-92位氨基酸所示的MYC标签。
[0086] 实施例2、RAK1基因提尚植物的耐喊性
[0087] 1、RAK1基因的突变体的鉴定
[0088] 从 ABRC (Ohio State University)购买 RAK1 基因的突变体 Salk_〇57147， 将其命名为rakl。 用引物对ATGGAGTCAATCCACTGCAATAGT(正向引物）和 TCATCTGTCGGATAATACTGAGT (反向引物）分别对Col-0和RAK1进行半定量PCR(图1)，内参 为 ACTIN，ACTIN 的引物为 GGTCGTACTACTGGTAITGTGCT 和 TGACAATITCACGCTCAGCT。结果表 明，rakl中无RAK1基因的表达。
[0089] 提取野生型拟南芥Col-0和rakl的总蛋白，分别得到Col-0总蛋白和rakl总蛋 白。通过免疫杂交的方法，用NIBS抗体中心利用序列1的534-683位氨基酸残基所示的多 肽免疫大鼠得到的RAK1特异抗体分别对Col-0总蛋白和rakl总蛋白进行检测，以TUBULIN 为内参，TUBULIN的抗体为TUBULIN特异抗体（BI0CW公司产品）。结果如图1中B和图2 中F所示，结果表明，rakl中无RAK1蛋白的表达。
[0090] 2、转RAK1基因拟南芥的制备
[0091] 将PCAMBIA1307载体BamHI和Sail识别位点间的DNA替换为实施例1的抗逆相 关蛋白RAK1基因（即序列表中序列2所示的DNA分子），其他序列均不变，得到重组载体 pCAMBIA1307-RAKl，pCAMBIA1307-RAKl表达氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质。
[0092] 将重组载体pCAMBIA1307-RAKl导入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌。按照文献 (Harry Klee，Robert Horsch，Stephen Rogers，张毅，农杆菌介导的植物转化及其将来在植 物生物学中的应用，生物工程进展，1988年05期）中的方法，通过该重组农杆菌对rakl进 行转化，并利用潮霉素筛选得到T0代转RAK1基因的植株。培养该T0代转RAK1基因的植 株，并得到T3代转RAK1基因的植株0E-1和0E-2。
[0093] 分别提取0E-1和0E-2的总蛋白，得到0E-1总蛋白和0E-2总蛋白。以步骤1的 Col-0总蛋白和rakl总蛋白为对照，通过免疫杂交的方法，用步骤1的RAK1特异抗体分别 对0E-1总蛋白和0E-2总蛋白进行检测，以TUBULIN为内参，TUBULIN的抗体为TUBULIN特 异抗体（BI0CW公司产品）。结果如图2中F所示。结果表明，0E-1和0E-2中均表达蛋白 (含有MYC标签，即图中MYC-RAK1)。
[0094] 3、0E-1和0E-2的耐碱性升高
[0095] 将步骤2的0E-160株在普通MS培养基上生长6天后分别转移到pH值分别为4. 8、 5. 8和8. 2的MS培养基上（每种pH的MS培养基20株），然后均在光照培养箱（光照强度 具体为：80 y mol photons m 2s 3 中培养 10 天，分别得到 pH 4. 8 的 0E-1、pH 5. 8 的 0E-1 和 pH 8. 2 的 0E-1。
[0096] 按照上述方法，分别将0E-1替换为野生型拟南芥Col-0、0E-2和rakl，其他步骤 均不变，分别得到 pH 4. 8 的 Col-0、pH 5. 8 的 Col-0、pH 8. 2 的 Col-0、pH 4. 8 的 0E-2、pH 5. 8 的 0E-2、pH 8. 2 的 0E-2、pH 4. 8 的 rakl、pH 5. 8 的 rakl、pH 8. 2 的 rakl。
[0097] 观察上述 pH 4. 8 的 0E-1、pH 5. 8 的 0E-1、pH8. 2 的 0E-1、pH 4. 8 的 Col-0、pH 5. 8 的 Col-0、pH8. 2 的 Col-0、pH 4. 8 的 0E-2、pH 5. 8 的 0E-2、pH 8. 2 的 0E-2、pH 4. 8 的 抑让14115.8的^1^14118.2的狀1(1的表型（图2中厶、8和〇，结果表明，在口11值为4.8 和5. 8的MS培养基上各种拟南芥间的生长状况基本无差异；在pH值为8. 2的MS培养基上 0E-1和0E-2的生长状态明显好于rakl以及Col-0,说明RAK1基因可以提高拟南芥对碱性 pH值的耐逆性。
[0098] 测量上述 pH 5. 8 的 0E-1、pH 8. 2 的 0E-1、pH 5. 8 的 Col-0、pH 8. 2 的 Col-0、pH 5. 8 的 0E-2、pH 8. 2 的 0E-2、pH 5. 8 的 rakl、pH 8. 2 的 rakl 的鲜重及主根长（图 2 中 D 和E及表2)。
[0099] 表2、转基因拟南芥及突变体的鲜重及主根长
[0101] 结果显示，在pH值为5. 8的MS培养基上，各种拟南芥的鲜重和主根长均无显著 差异。在pH值为8. 2的MS培养基上，0E-1与0E-2的鲜重和主根长无均显著差异。在pH 值为8. 2的MS培养基上，0E-1的鲜重为rakl的2. 21倍，差异达到显著水平；0E-1的鲜重 为Col-0的1. 07倍；0E-2的鲜重为rakl的2. 40倍，差异达到极显著水平；0E-2的鲜重为 Col-0的1. 16倍，差异达到显著水平。在pH值为8. 2的MS培养基上，0E-1的主根长为rakl 的1. 69倍，差异达到显著水平；0E-1的主根长为Col-0的1. 24倍，差异达到显著水平；0E-2 的主根长为rakl的1. 85倍，差异达到显著水平；0E-2的主根长为Col-0的1. 36倍，差异 达到显著水平。结果表明，RAK1基因或其编码的蛋白RAK1可以提高植物的耐碱性。
[0102] 在pH值为8. 2的MS培养基上，rakl的鲜重为Col-0的0. 48倍，差异达到显著水 平；rakl的主根长为Col-0的0. 73倍，差异达到显著水平。结果表明，RAK1基因突变后植 物的耐碱性下降。
【主权项】
1. 抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆相关蛋白是如下a)或b)或c) 或d)的蛋白质： a) 氨基酸序列是序列表中序列1的第93-774位氨基酸的蛋白质； b) 将序列表中序列1的第93-774位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质； c) 氣基酸序列是序列表中序列1的蛋白质； d) 将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的具有相同蛋白功能的蛋白质。2. 与权利要求1所述抗逆相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用； 所述与权利要求1所述抗逆相关蛋白相关的生物材料，为下述C1)至C20)中的任一 种： C1)编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的核酸分子； C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒； C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体； C4)含有C2)所述表达盒的重组载体； C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物； C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物； C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物； C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物； C9)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； CIO)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系； C11)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系； C12)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系； C13)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织； C14)含有C2)所述表达盒的转基因植物组织； C15)含有C3)所述重组载体的转基因植物组织； C16)含有C4)所述重组载体的转基因植物组织； C17)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官； C18)含有C2)所述表达盒的转基因植物器官； C19)含有C3)所述重组载体的转基因植物器官； C20)含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3) 或4)或5)或6)所示的基因： 1) 核苷酸序列是序列表中序列2的第277-2325位核苷酸的cDNA分子或DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述RAK1的cDNA分 子或基因组DNA分子； 3) 在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述RAK1的cDNA分子或基因组 DNA分子； 4) 核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子； 5) 与4)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为序列1 的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子； 6) 在严格条件下与4)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列1的蛋白质的 cDNA分子或基因组DNA分子。4. 根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子 叶植物。5. -种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述抗逆相 关蛋白的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求1所述抗逆相关蛋白的编码基 因的编码序列是序列表中序列2的DNA分子。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植 物。8. 根据权利要求1-4中任一所述的应用、或权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在 于：所述抗逆性为耐碱性。9. 权利要求1所述的抗逆相关蛋白。10. 权利要求2或3所述的生物材料。
【文档编号】A01H5/00GK105820220SQ201510003844
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】郭岩, 杨永青, 王治
【申请人】中国农业大学