一种水稻叶色调控蛋白及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一种叶色调控蛋白质，如(A)Seq ID No：3所示的氨基酸序列；或(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有调控叶色功能的由(A)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码上述蛋白质的核酸(如SEQ ID No：1所示等)、含有该核酸的重组载体、转化体、利用该核酸调控植物叶色的方法，以及上述蛋白、核酸等在调控植物叶色或植物杂交种纯度鉴定中的应用：本发明利用水稻白条纹叶突变体，通过图位克隆技术克隆到了FS1基因，利用转基因互补实验鉴定该基因的功能，进一步阐明了水稻叶绿体发育的遗传机制及其作用机理，为生产实践打下了基础。
【专利说明】
一种水稻叶色调控蛋白及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种水稻叶色调控蛋白及其编码 基因与应用。
【背景技术】
[0002] 叶片作为植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，能通过光合作用把光能转变 为化学能，是人类主要的物质和能量来源。在水稻中，叶片是光合作用的主要部分，水稻将 近有95%的干物质积累是由光合作用合成的。叶色突变是指叶色表型发生了变异，主要表 现为不正常的白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿和条纹等。突变基因直接或间接影响叶绿 素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以大部分叶色突变体同时也是叶绿素突变体。叶色 突变通常在苗期表达，目前在水稻中已经定位约80个叶色突变位点，并已成功克隆出多个 叶色相关基因。例如，水稻白条纹叶基因Stl(Stripe 1)编码核糖核酸还原酶RNR小亚基 RNRS1，RNR调节DNA合成和修复过程中脱氧核糖核苷酸的形成速率，该基因功能缺失后导 致白条纹叶出现。
[0003] 水稻叶色突变体是研究叶绿体发育的良好材料，叶色基因为揭示叶绿体发育的分 子机制提供了切入点，如何发掘更多的叶色突变体，了解它们的分子作用机理，为生产实践 提供理论基础，实属当前重要研发课题之一。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种能调控植物叶色的蛋白质及其核酸，以及由 此获得的重组载体、转化体，和调控水稻叶色的方法及应用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种叶色调控蛋白质，如（A)或（B)所示的序 列：
[0006] (A)Seq ID No :3所示的氨基酸序列；
[0007] (B)在（A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸 且具有调控叶色功能的由（A)衍生的蛋白质。
[0008] 上述SEQ ID No :3所示的蛋白质属于一类表达蛋白，为具有Hd结构域的磷酸水解 酶类似蛋白。
[0009] 本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸。
[0010] 作为本发明进一步的改进，所述核酸为编码上述蛋白质的基因，所述基因如（a)、 (b)或（c)所示的序列：
[0011] (a)Seq ID No :1所示的核苷酸序列；
[0012] (b)其编码区序列如Seq ID No : 2所示；
[0013] (c)在（a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸 而生成的可编码具有调控叶色功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。
[0014] 上述Seq ID No :1所示的核苷酸序列被命名为水稻白条纹叶基因FS1，是一种从 水稻突变体fsl中克隆的新基因，其包括编码FS1蛋白的编码区序列（Seq ID N〇:2所示）。
[0015] 本发明还提供了一种含有上述核酸的重组载体。
[0016] 本发明还提供了一种含有上述核酸的转化体。
[0017] 作为本发明的进一步改进，所述转化体的宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细 胞。
[0018] 本发明还提供了一种调控植物叶色的方法，用上述的核酸转化植物细胞，再将转 化后的植物细胞培育成植株。
[0019] 本发明还提供了一种上述的蛋白质、核酸、重组载体或转化体在如下（al)或（a2) 中的应用：
[0020] (al)调控植物的叶色；
[0021] (a2)植物杂交种纯度的鉴定。
[0022] 作为本发明进一步的改进，所述的植物为单子叶植物。
[0023] 作为本发明进一步的改进，所述单子叶植物为水稻。
[0024] 本发明利用水稻白条纹叶突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了 FS1 (FINE STRIPE 1)基因，利用转基因互补实验鉴定该基因的功能，通过对FS1基因的功 能解读，进一步阐明了水稻叶绿体发育的遗传机制及其作用机理，为生产实践打下了基础， 在生产实践中可用以调整植物叶色或进行植物杂交种纯度的鉴定，提高水稻产量。
【附图说明】
[0025] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0026] 图1是突变体fsl与野生型材料的表型对比图；
[0027] 图2是突变体fsl与野生型叶肉细胞叶绿体结构的对比图；
[0028] 图3是图2的局部放大图；
[0029] 图4是突变体fsl与野生型叶绿素含量对比图；
[0030] 图5是FS1基因在水稻第1染色体上的初步定位图；
[0031] 图6是FS1基因的精细定位图；
[0032] 图 7 是 pCAMBIA1300-FSl 载体图谱；
[0033] 图8是功能互补实验转基因水稻植株的表型；
【具体实施方式】
[0034] 本发明的蛋白质和核酸，是通过图位克隆技术及转基因互补实验获得的，获得步 骤如下：
[0035] -、突变体fsl的分离和遗传分析：
[0036] 本发明的水稻白条纹叶突变体fsl来自粳稻品种中花11 (Nipponbare)EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变体受隐性单 基因控制，如图1所示。
[0037] 二、突变体fsl与野生型叶肉细胞叶绿体结构、叶绿素含量比较：
[0038] 突变体fsl叶肉细胞叶绿体中类囊体数目明显下降，嗜锇颗粒增加，淀粉含量明 显减少（如图2、3所示）。
[0039] 突变体fsl叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素含量相比野生型都显著减少。（如图 4所示）
[0040] 三、图位克隆FS1基因：
[0041] 1)FS1的初步定位：
[0042] 为了分离FS1基因，本发明首先组建了一个定位群体，由fsl与籼稻品种 NJ06(Indica)杂交组配成匕定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记 对FS1位点进行初步定位，将其初步定位在第1染色体上，并介于RM3252与gcw47两标记 之间，见图5。
[0043] 2)FS1的精细定位：
[0044] 通过对RM3252和gcw47两个标记之间的BAC序列分析，发展新的STS标记将FS1 精确定位于BAC P0482C06上、gcw56和gcw24标记之间50. 5kb范围之内（图6,通过分析 此区段开放阅读框（0RF)推测候选基因。
[0045] 3) FS1基因的鉴定和功能分析：
[0046] 通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻 (图8)，证明了本发明正确克隆了 FS1基因，氨基酸序列分析表明FS1编码一个具有HD结 构域的磷酸水解酶类似蛋白。
[0047] 实施例1 :
[0048] 1、水稻材料
[0049] 水稻（Oryza sativa L.)突变体fsl，原始野生材料为粳稻品种"中花11"。fsl 来自中花llEMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变（如图1所示）。fsl突变体 在中国浙江省境内获得。
[0050] fsl通过与野生型水稻（即，粳稻品种"中花11 "）的正反交实验，证明该突变体 受隐性单基因控制。
[0051] 2、分析和定位群体：
[0052] 纯合的fsl突变体和籼稻品种NJ06号进行杂交，Fi代自交，得到6500株F 2群体； 并从6500株匕群体中挑选出1900株具有白条纹表型的个体作为定位群体。在灌浆期每 株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
[0053] 3、SSR和STS标记定位FS1基因：
[0054] 采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组 DNA。取大约0. 2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1. 5ml 离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150 y 1超纯水中。每一个PCR反应用1 y 1 DNA 样品。
[0055] 3. 1 FS1基因的初步定位：从fsl与NJ06号杂交组合的F2群体1900个隐性个体 中随机选取200个隐性个体，组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分 子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR 扩增。具体如下：
[0056] PCR 反应体系为：100ng/yl 水稻基因组 DNA lyl, 10XPCR Buffer lyl，2mM dNTP 1 y 1，10 y M 引物 2 y 1，5U/ y 1 rTaq0.0 5 y 1，ddH20 4. 95 y 1，总体系为 10 y 1。
[0057] PCR扩增条件具体为：94°C预变性4分钟；94°C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延 伸30秒，38个循环；
[0058] 经4%琼脂糖凝胶电泳分离和Gelred染色，检测PCR产物的多态性，将FS1初步定 位在第1号染色体短臂上STS标记和RM3252和gcw47之间。
[0059] 3. 2 FS1基因的精细定位：利用fsl与NJ06号组合的F2群体中共计 1700(1900-200 = 1700)株隐性个体，在初定位的基础上继续设计STS标记，最终将FS1精 确定位于BAC P0482C06上、gcw56和gcw24标记之间50. 5kb范围之内。引物序列如表1所 示：
[0060] 表1 FS1基因的定位标记序列
[0062] 4、基因预测和比较分析：
[0063] 根据精细定位的结果，在50. 5kb范围内根据Rice Genome Annotation Project http://rice. plantbiology. msu. edu/)的预测，发现在此IX间内共有12个候选基因，其中 BAC克隆P0482C06上498454-506264区间被预测为编码具有18个外显子的Hddomain磷酸 水解酶蛋白。采用PCR方法分别从fsl和野生型品种基因组中扩增出这些候选基因进行测 序分析。最终只发现fsl在该基因第17个外显子发生了碱基A到T的替换，导致编码蛋白 发生了变化。将这些结果分别重复验证两次，发现突变体fsl基因与野生型比较都有突变 事件的发生（测序引物序列见表2)。该基因在水稻中为一新的基因，编码一个具有Hd结构 域的磷酸水解酶。水稻中的FS1基因与大肠杆菌中的完全不同，同源性也较远。
[0064] PCR 反应体系为：100ng/ y 1 水稻基因组 DNA 2 y 1，K0D Buffer 25 y 1，2mM dNTP 10 y 1，10 y M 引物 4 y 1，K0D Fx 1 y 1，ddH20 8 y 1，总体系为 50 y 1。
[0065] PCR扩增条件具体为：94°C预变性2分钟；98°C变性10秒，60°C退火30秒，68°C延 伸90秒，35个循环；
[0066] 经1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶送测序公司测序（南京金斯瑞生物技术有限公 司），结果分析。
[0067] 表2 FS1基因的测序引物
[0069] 实施例2
[0070] 植物转化
[0071] 将BAC克隆P0482C06用BamHI和Hindlll完全酶切，电泳分离后，回收12160bp 的DNA片段连接到pCAMBIA1300中，获得了互补载体pCAMBIA1300-FSl，该克隆覆盖了整个 0RF的基因组区域（即包含了 SEQ ID No :1所示的核苷酸序列），还包括ATG上游2, 400-bp 启动子序列和TGA下游1959-bp终止子序列（如图7所示），该载体可以表达有上述核苷酸 序列编码的多肽或其同源类似物。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们分别利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱 导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105 菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25°C条件下共培养3天后，在含有300mg/LG418的筛选培养基 上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L G418预分化培养基上培养10天左右。将预分化的 愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行 鉴定和连续的观察，发现植株叶色恢复正常。通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得 了使突变体恢复正常表型的转基因水稻（如图8所示）。
[0072] 由上述实验结果可以确定，SEQ ID No :3所不的蛋白质序列具有调控叶色的功能。 通过常规方法在上述氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸而得到的 具有调控叶色功能的由上述序列衍生的蛋白质，本领域技术人员可以合理预期其也属于本 发明的保护范围。
[0073] 上述蛋白质编码的核酸可为cDNA或RNA或是如SEQ ID No :1所示的基因序列，该 基因的编码区序列如SEQ ID No :2所示。通过常规方法在上述SEQ ID No :1所示的核苷酸 序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而得到的可编码具有调控叶色功能的 蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物，本领域技术人员可以合理预期其也属于本发明的 保护范围。
[0074] 上述实施例中仅列举了 PCAMBIA1300作为重组载体的表达载体，以及以农杆菌株 系EHA105作为转化体的宿主细胞的优选实施例，实际上，上述表达载体可以选择现有较为 成熟的PCAMBIA1301或其他衍生植物表达载体等。上述转化体的宿主细胞还可选择大肠杆 菌细胞或植物细胞等。
[0075] 在生产实践中，可将上述核酸转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。 通过该转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶绿体的发育，进而可以 调控植物叶色，如影响水稻等单子叶植物的白条纹。
[0076] 另外，在生产实践中，还可以将上述蛋白质、核酸、重组载体或转化体应用在植物 杂交种纯度的鉴定上。
[0077] 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上 实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变 形，均应认为是本发明的保护范围。
[0078]
【主权项】
1. 一种叶色调控蛋白质，其特征在于，如（A)或（B)所示的序列： (A) Seq ID No :3所示的氨基酸序列； (B) 在（A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具 有调控叶色功能的由（A)衍生的蛋白质。2. -种编码权利要求1所述蛋白质的核酸。3. 根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸为编码权利要求1所述的蛋白质 的基因，所述基因如（a)、（b)或（c)所示的序列： (a) Seq ID No :1所示的核苷酸序列； (b) 其编码区序列如Seq ID No :2所示； (c) 在（a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生 成的可编码具有调控叶色功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。4. 一种含有权利要求2或3所述核酸的重组载体。5. -种含有权利要求2或3所述核酸的转化体。6. 根据权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞为大肠杆菌细 胞或农杆菌细胞。7. -种调控植物叶色的方法，其特征在于，用权利要求2或3所述的核酸转化植物细 胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。8. -种权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸，或权利要求4所述的 重组载体，或权利要求5或6所述的转化体的应用，其特征在于： (al)调控植物的叶色； 或（a2)植物杂交种纯度的鉴定。9. 根据权利要求7或8中所述的方法或应用，其特征在于，所述的植物为单子叶植物。10. 根据权利要求9所述的方法或应用，其特征在于，所述单子叶植物为水稻。
【文档编号】C12N15/82GK105820221SQ201510932901
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月14日
【发明人】郭龙彪, 钱前, 葛常伟, 任德勇, 薛大伟, 胡江, 胡时开, 董国军, 曾大力
【申请人】中国水稻研究所