硫酸化透明质酰脂肪烃胺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型药物载体硫酸化透明质酰脂肪烃胺及其应用。它是在透明质酸(HA)骨架上引入疏水性基团脂肪烃胺以及亲水性基团硫酸根而形成的，具有两亲性，在水中可自组装形成聚合物胶束，包载难溶性药物、蛋白质药物、基因类药物。该硫酸化透明质酰脂肪烃胺具有抑制肿瘤生长，易形成载药聚合物纳米粒，稳定性好，包封率高，制备工艺简单，易于大规模生产等特点。
【专利说明】
硫酸化透明质酰脂肪烃胺
技术领域
[0001] 本发明涉及高分子材料技术领域、药用辅料或药物制剂领域，特别涉及一种硫酸 化透明质酰脂肪烃胺和其制备方法以及作为药物载体的应用。
【背景技术】
[0002] 聚合物胶束是由两亲性聚合物在选择性溶剂(通常是水）中自组装形成的一种核 壳超分子结构。聚合物胶束的形成是一个自发的过程，在水溶液中，当两亲性聚合物的浓度 达到或超过某个临界值（即临界胶束浓度)时，聚合物的疏水端由于受到水分子的排斥等作 用缠绕形成疏水性内核，而亲水段则会分布在疏水性内核周围形成亲水性外壳。聚合物胶 束具有较大的药物增溶空间，显著提高包埋药物的水溶解度，增加药物的稳定性，改善药物 体内生物药剂学的特性，通过聚合物表面的修饰，可提高肿瘤药物的主动靶向功能，增强药 物活性，降低毒性，但是许多全合成聚合物胶束材料安全性有待研究。
[0003] 透明质酸(Hyaluronan，HA)是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸经e-l，4 糖苷键连接而成的线性多糖，人体内天然HA的相对分子质量分布广泛，由1000到1000万不 等，因HA水溶性好，生物可降解，生物相容性好，无毒，无免疫原性，容易进行化学修饰等特 点，HA作为药物载体被广泛应用。HA通过与细胞表面HA受体CD44和RHAM结合，调节细胞的生 长，增殖和迀移，尤其在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要的作用。其中CD44是癌细胞表面 过量表达的最重要的HA受体，是与HA结合的主要部位，研究HA纳米粒在肿瘤主动靶向方面 具有重要的意义。但是HA和HA纳米材料本身对肿瘤细胞的增殖和转移的影响值得关注和研 究。
[0004] 对多糖进行硫酸化改性，如硫酸化肝素、皮肤素、软骨素、壳聚糖、香菇多糖显示具 有多种生物活性，如抗凝血活性、抗病毒活性，特别是抗艾滋病病毒(HIV)等。由于它们的毒 副作用小，有的已经应用于临床，显示了广泛的应用前景和深远意义。
[0005] Anaid Benitez等发现硫酸化透明质酸一方面通过下调Bcl_2、磷酸化-Bad水平， 诱导依赖caspase-8型凋亡，另一方面通过下调HA受体的水平，从而抑制前列腺癌细胞如 LNCaP，LNCaP-A 1，DU 145，LAPC-4的生长。动物模型实验中也显示，硫酸化透明质酸对于 LNCaP-Al型前列腺癌细胞具有很强的抑制作用，同时不会导致明显的体重减轻及血清毒性 (Anaid Benitez,Travis J.Yates,Luis E.Lopez,et alTargeting Hyaluronidase for Cancer Therapy：Antitumor Activity of Sulfated Hyaluronic Acid in Prostate Cancer Cel Is，Cancer Re s;71(12); 4085-95) D Stephan ieMSller 等合成硫酸化透明质酸和 硫酸化甲基透明质酸，通过靶向I型疱疹病毒证明二者均有抗病毒活性，且抗病毒活性随着 硫酸化程度的提高而增强（Stephanie MSller, Michaela Schmidtke，DieterWeiss，et al ?， Synthesis and AntiherpeticActivity of Carboxymethylated and Sulfated Hyaluronan Derivatives ? Carbohydrate Polymers;90(2012):608-615)。但是这种生物活 性的硫酸化HA是水溶性性，不具有两亲性，不能作为药物纳米载体材料。
[0006] 本发明是将透明质酸上的羟基改性为硫酸根基团，并在HA羧基上接枝疏水性的脂 肪烃胺，发明一种硫酸化透明酰脂肪烃胺。它是两亲性聚合物纳米材料，引入的脂肪烃胺是 疏水基团，有利于形成疏水内核，包裹药物，引入的硫酸根同时有利于改善材料本身的亲水 性，形成亲水性外壳，提高药物对CD44过量表达癌细胞的靶向作用；同时硫酸化透明质酰脂 肪烃胺本身具有一定的抗肿瘤活性，是一种潜在的抗肿瘤活性纳米材料，且无毒，生物相容 性好。
[0007] 目前尚没有将硫酸化透明质酸接枝脂肪烃胺制备抗肿瘤纳米材料的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明描述并要求一种新型硫酸化透明质酰脂肪烃胺、其制备方法以及其作为药 物胶束载体材料的应用；它是一种安全性好、可生物降解、临界胶束浓度低的两亲性聚合 物，可在水中自组装形成聚合物胶束，作为纳米药物传递系统，同时材料本身具有抑制肿瘤 生长的作用。
[0009] 本发明的目的在于提供一种硫酸化透明质酰脂肪烃胺及其制备方法。
[0010] 本发明的目的在于提供硫酸化透明质酰脂肪烃胺在药物制剂领域的应用。
[0011] 本发明涉及的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其特征是在透明质酸骨架上引入疏水性 基团脂肪烃胺以及亲水基团硫酸根，使其具有两亲性，可在水中自组装形成聚合物胶束。
[0012] 本发明所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，是指疏水性的脂肪烃胺通过酰胺键接枝 到透明质酸中葡萄糖醛酸-N乙酰葡萄糖胺重复单元的羧基上，亲水性基团硫酸根取代透明 质酸重复单元上的羟基。
[0013] 本发明所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其中接枝的疏水性基团脂肪烃胺的总取 代度为为5 %~40 %。
[0014]本发明所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其中硫酸化率为2~30%。
[0015] 本发明所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其特征在于选用的HA分子量为5X103~ 5X105Da〇
[0016] 具体地，本发明提供了一种硫酸化透明质酰脂肪烃胺的制备方法，包括以下过程： [0017] 透明质酸钠(HA-Na)溶于双蒸水中，室温下磁力搅拌过夜；另称取适量Dowex WX8 阳离子交换树脂（四丁铵型)加入HA-Na中，室温下磁力搅拌过夜，过滤，冷冻真空干燥，40 °C 下真空干燥，得透明质酸四丁铵盐(TeBA-HA);
[0018] TeBA-HA溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，50 °C磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取 一定量的硫酸化剂（三氧化硫吡啶络合物）溶于DMF中，室温下搅拌至溶解后，加入上述 TeBA-HA溶液中，充氮保护，室温磁力搅拌20min;反应液加入冰水终止反应，1M NaOH溶液调 节pH至9.0,加入乙醇洗涤、离心2次，沉淀用水溶解后蒸馏水透析ld，冷冻真空干燥，室温下 真空干燥得硫酸化透明质酸(sHA);
[0019] sHA溶于甲酰胺中，50°C磁力搅拌2h使其溶解，冷却至室温后，加定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，冰浴下反应2h;另精 密称取一定量脂肪烃胺(ALA)溶于DMF中，将其逐滴加入sHA溶液中，充氮保护，35°C磁力搅 拌24h;反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用水溶解后蒸馏水透析2d，冷冻真空干燥得硫 酸化透明质酰脂肪烃胺(sHA-ALA)。
[0020]本发明所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，可包载难溶性药物(如多西紫杉醇等）、 基因类药物、蛋白质药物，制成载药聚合物胶束纳米粒。
[0021] 本发明所述的载药聚合物纳米粒是将硫酸化透明质酰脂肪烃胺溶于双蒸馏水，自 组装成浓度为1~5mg/mL的空白胶束溶液，将难溶或微溶性药物溶于有机溶剂后，逐滴加入 上述的空白胶束溶液中，经超声处理后，置于双蒸馏水中透析除去有机溶剂，透析液经离 心、过滤后，必要时冻干，制得粒径为1~l〇〇〇nm的聚合物载药胶束。
[0022] 上述硫酸化透明质酰脂肪烃胺，具有抑制肿瘤生长，易形成载药聚合物纳米粒，制 备纳米粒工艺简便，纳米粒胶束稳定性好，包封率高，纳米粒给药途径多等特点。
【附图说明】
[0023]图1:硫酸化透明质酸的IR图谱
[0024]图2:硫酸化透明质酰十八胺的1H-NMR图谱
[0025]图3:硫酸化透明质酰十八胺的Im/Im与聚合物对数浓度关系图
[0026]具体实施方法
[0027]通过下面实施例说明本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围，不局限于此。
[0028]实施例1透明质酸四丁铵盐的制备
[0029] 透明质酸钠(1^5000，骱-他，2.(^)溶于4001^双蒸水中，室温下磁力搅拌过夜；另 称取20g Dowex WX8阳离子交换树脂（四丁铵型）加入HA-Na中，室温下磁力搅拌过夜混，过 滤，冷冻真空干燥，40°C下真空干燥，得透明质酸四丁铵盐(TeBA-HA)。
[0030]实施例2硫酸化透明质酸(sHA)的制备
[0031] 精密称取实施例1中的TeBA-HA(MW5000,500mg)溶于25ml N，N'_二甲基甲酰胺 (DMF)中，50°C磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取1400mg的硫酸化剂三氧化硫吡啶络合物 (S03 ? Py)溶于25mL DMF中，室温下搅拌至溶解后，加入TeBA-HA中，充氮保护，室温磁力搅 拌20min;反应液加入100mL冰水终止反应，1M NaOH溶液调节pH至9.0，加入乙醇洗涤、离心2 次，沉淀用水溶解后蒸馏水透析2d，冷冻真空干燥，室温下真空干燥得硫酸化透明质酸 (sHA)。IR图谱确认sHA结构(见图1) JMMB法测定硫酸化程度，硫含量(S% )为5.56%。
[0032]实施例3硫酸化透明质酰十八胺(sHA-ODA)的制备
[0033] 精密称取实施例2中的sHA(lOOmg)溶于5ml甲酰胺中，50°C磁力搅拌2h使其溶解， 冷却至室温后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，95mg)、N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS，58mg)，冰浴下反应2h;另精密称取一定量十八胺(0DA)溶于9mLDMF中，将其逐 滴加入sHA溶液中，充氮保护，35 °C磁力搅拌24h;反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用水 溶解后蒸馏水透析2d，冷冻真空干燥得硫酸化透明质酰十八胺（sHA-ODA) ^H-NMR图谱（见 图2)确认sHA-ODA结构。
[0034]实施例4 sHA-ODA临界胶束浓度的测定
[0035] 精密称取10mg sHA-ODA，分散于少量蒸馏水中，磁力搅拌24h，冰浴探头超声30min (超声功率95W，工作2s，间歇5s)，定容至10mL，得lmg/mL的空白胶束溶液;将lmg/mL的空白 胶束溶液稀释至 sHA-ODA 浓度(C)为 1X10-3、2X10-3、5X10-3、1X10-2、2.5X10- 2、5X10-2、 7.5 X 10'1 X 10'5 X HTVg/mL的系列胶束溶液，分别加入定量的芘（终浓度为5 X 10-6mo 1/L)中，混合液超声30min，60 °C水浴lh，40°C避光水浴过夜，利用荧光分光光度计测定 芘的荧光强度。激发波长为335nm，发射波长I^371nm，I 3为382nm，狭缝宽度Ex为3nm，EM为 3nm〇
[0036]以lgC(g/L)与芘在371nm和382nm出的荧光强度比值（h/13)作图（见图3)，曲线的 拐点对应的聚合物浓度即为该聚合物材料的临界胶束浓度(CMC)。计算得sHA-ODA的CMC值 为60 . lyg/mL。由此表明sHA-ODA胶束的临界胶束浓度比较小，以此制备的载药胶束具有较 好的稀释稳定性。
[0037] 实施例5空白sHA-ODA胶束纳米粒的制备
[0038] 按1~5mg/mL的浓度将两亲性sHA-ODA溶于蒸馏水中，经超声处理制备成粒径为 100~lOOOnm的空白胶束纳米粒溶液(sHA-ODA NDs)。
[0039]实施例6载多西紫杉醇sHA-ODA胶束纳米粒的制备
[0040] l〇mg sHA-ODA溶于蒸馏水制得浓度2mg/mL的空白胶束溶液，将2. Omg的多西紫杉 醇（DTX)溶于400此甲醇中，逐滴加入到上述空白胶束溶液中，冰浴超声30min(超声功率 95W，工作2s，间歇5s)，置于蒸馏水中透析除去甲醇，透析液经离心，过滤后，制得粒径为1~ 300nm的载药sHA-ODA胶束纳米粒(DTX-sHA-〇DA NPs)。表1是DTX-sHA-〇DA胶束纳米粒及空 白胶束纳米粒的一些性质。
[0041] 表1 DTX-sHA-ODA胶束纳米粒及空白胶束纳米粒的一些性质
[0043] 结果显示，硫酸化透明质酰十八胺（sHA-ODA)这种两亲性材料，可在水中自发形成 胶束，且纳米粒粒径小于250nm，药物包封率高（> 98 % )，对多西紫杉醇有明显的增溶作用。
[0044] 实施例7 DTX-sHA-ODA NPs体外对肿瘤细胞的抑制作用
[0045] 纳米制剂组:DTX-sHA-ODA NPs，培养液稀释至浓度为0.41yM~100yM。
[0046] 阳性对照组:市售制剂多西紫杉醇注射液，培养液稀释至浓度为0.41yM~100yM。 [0047]阴性对照组:sHA-ODA空白胶束纳米粒，培养液稀释至上述相同浓度。
[0048]取处于指数生长期状态良好的人乳腺癌细胞MCF-7，加入0.25 %胰蛋白酶消化液， 消化使贴壁细胞脱落，计数制成细胞悬液;分别以6 X103个/孔的密度接种于96孔培养板 中，置C〇2培养箱中培养24h;按上述实验方案分别给予所需浓度的纳米制剂组、阴性对照 组、阳性对照组溶液，每一浓度平行6孔，继续培养。24h后，向每孔加入10此MTT液，放入孵 箱4h后，向每孔加入150yL DMS0，使用酶标仪检测490nm处吸光度。处理数据，计算半数抑制 浓度IC5Q值(见表2)。
[0049] 表2 DTX-sHA-ODA NPs体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用（IC5q值）
[0051] 结果显示，sHA-ODA空白胶束纳米粒（阴性对照组)对于乳腺癌细胞的生长不仅没 有促进作用，且具有一定的抑制作用。DTX-sHA-ODA NP制剂组的IC5Q小于多西紫杉醇注射液 (阳性对照组)3.1倍，说明载药sHA-ODA NPs能使多西紫杉醇对乳腺癌细胞毒性明显增强， 可能是通过CD44受体介导的主动靶向作用将药物递送至肿瘤细胞，提高抗肿瘤活性。
[0052]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但只是作为范例，本发明并不限制 于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替 代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修 改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其特征是在于（1)它是透明质酸(HA)骨架的羧基上引入 疏水性基团脂肪烃胺以及在HA的羟基上引入亲水基硫酸根而形成的，具有两亲性，（2)在水 中能自组装形成聚合物胶束，作为难溶性药物、蛋白质药物、基因类药物的纳米载体，其包 含η个重复单元并具有以下结构通式(I):式中，m= 10~17中任意一个整数。2. 根据权利要求1所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其中HA的分子量为5 X103~5 X 105Da〇3. 根据权利要求1所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其中疏水性基团脂肪烃胺的取代 度为5%~40%。4. 根据权利要求1所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其中硫酸化率为2~30 %。5. 根据权利要求1所述的硫酸化透明质酰脂肪烃胺，其制备方法包括以下过程： 透明质酸钠(HA-Na)溶于双蒸水中，室温下磁力搅拌过夜；另称取适量Dowex WX8阳离 子交换树脂（四丁铵型）加入HA-Na中，室温下磁力搅拌过夜，过滤，冷冻真空干燥，40 °C下真 空干燥，得透明质酸四丁铵盐(TeBA-HA); TeBA-HA溶于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，50°C磁力搅拌5h使其溶解；另精密称取一定 量的硫酸化剂(三氧化硫吡啶络合物)溶于DMF中，室温下搅拌至溶解后，加入上述TeBA-HA 溶液中，充氮保护，室温磁力搅拌20min;反应液加入冰水终止反应，1M NaOH溶液调节pH至 9.0，加入乙醇洗涤、离心2次，沉淀用水溶解后蒸馏水透析Id，冷冻真空干燥，室温下真空干 燥得硫酸化透明质酸(sHA); sHA溶于甲酰胺中，50°C磁力搅拌2h使其溶解，冷却至室温后，加定量的1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，冰浴下反应2h;另精密称 取一定量脂肪烃胺(ALA)溶于DMF中，将其逐滴加入sHA溶液中，充氮保护，35°C磁力搅拌 24h;反应液加入乙醇洗涤、离心两次，沉淀用水溶解后蒸馏水透析2d，冷冻真空干燥得硫酸 化透明质酰脂肪烃胺(sHA-ALA)。6. -种载药聚合物纳米粒的组合物，其特征在于，如权利要求1~5任何一项所述的硫 酸化透明质酰脂肪烃胺，包载难溶性药物、蛋白质药物、基因类药物，制成载药聚合物胶束 纳米粒，加上医药学上可接受的辅料制备而成的药物组合。7. 根据权利要求6中所述的载药聚合物纳米粒组合物，其制备方法包括以下过程:将硫 酸化透明质酰脂肪烃胺溶于双蒸馏水，自组装形成浓度为1~5mg/mL的空白胶束溶液，将难 溶或微溶性药物溶于有机溶剂后，逐滴加入上述的空白胶束溶液中，经超声处理后，置于双 蒸馏水中透析除去有机溶剂，透析液经离心、过滤后，必要时冻干，制得粒径为1~l〇〇〇nm的 聚合物载药胶束。
【文档编号】A61K9/107GK105820270SQ201610201033
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】栾立标, 蒲嘉琪
【申请人】中国药科大学