一种曲霉菌f菌株及其筛选方法和应用

一种曲霉菌f菌株及其筛选方法和应用
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种曲霉菌F菌株及其筛选方法和应用。一种曲霉菌F菌株，保藏号为：CGMCC NO.1176。所述菌株筛选方法为将新鲜瓦式马尾藻加入陈海水直至马尾藻腐烂，马尾藻腐烂液稀释后涂布在选择培养基上，待菌落长出后筛选出后并提纯。本发明提供的曲霉菌F菌株可分泌纤维素酶，而且在应用时，利用马尾藻粉作为纤维素底物诱导产酶，直接将该菌株的酶解系统与马尾藻藻体纤维素直接作用，能有效酶解马尾藻中的纤维素物质，将其降解为还原糖等单糖物质，为生物乙醇的发酵直接提供发酵底物。本发明将难以利用的纤维素物质进行生物乙醇的生产，设备简单，反应温和，操作简便，适合大规模工业化生产。CGMCC No.1176720151130
【专利说明】
一种曲霉菌F菌株及其筛选方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种曲霉菌F菌株及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 化石燃料作为一种能源在商业、交通、工业等方面有着不可替代的作用，随着现代 化工业的加速发展和世界人口的逐步增加，人们对能源的需求量越来越大。据一项国际报 道，在未来30年里，人们对能源的需求量将会增加53%。生物乙醇作为一种清洁无污染的可 再生能源受到各个国家的广泛关注，不仅能够作为燃料直接使用，同时还能混合汽油中供 给汽车使用，能大大降低人们对化石燃料的依赖度。
[0003] 藻类生物质作为第三代燃料乙醇的生产原料以其生长周期短，生长速率快和生物 量巨大的优势战胜了第一代和第二代燃料乙醇。马尾藻主要产于我国广东沿海和海南等地 区，是一种大型海洋褐藻，资源丰富。马尾藻富含氨基酸、纤维素、微量元素以及多糖类，可 用于藻胶的制作以及作为第三代燃料乙醇的生产原料。纤维素是D-葡糖糖以0-1，4糖苷键 为基环组成的大分子多糖[1]，通常与木质素、半纤维素组合在一起，结构稳定，难降解。相 对于物理和化学方法降解纤维素时的设备要求高、时间长等缺点，纤维素酶作为酶解纤维 素快速高效的方法被人们所熟知，但商品纤维素酶价格昂贵，不适合工业化大规模生产。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种曲霉菌F菌株，该菌株能够分泌纤维素酶，对马尾藻体所 含有的纤维素类物质进行有效降解，可将纤维素降解为还原糖等单糖物质，为马尾藻的进 一步资源化利用提供技术保障。
[0005] 本发明的目的是提供一种曲霉菌F菌株，该菌株能够分泌纤维素酶，对马尾藻体所 含有的纤维素类物质进行有效降解，可将纤维素降解为还原糖等单糖物质，为马尾藻的进 一步资源化利用提供技术保障。
[0006] 本发明的另一幕的是提供一种曲霉菌F菌株的筛选方法。
[0007] 本发明的另一幕的是提供一种曲霉菌F菌株酶解马尾藻的应用方法。
[0008] 为了实现以上技术效果，本发明通过如下技术方案来实现：
[0009] 一种曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)，其特征在于:保藏号为:CGMCC N0.1176。 [0010]所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)的筛选方法，其步骤包括：
[0011] (1)称取新鲜瓦式马尾藻于烧杯中，加入陈海水，用八层纱布扎住封口，外加一层 锡箱纸，于恒温培养箱中培养，直至马尾藻腐烂；
[0012] (2)将步骤（1)中的腐烂马尾藻液体，稀释后涂布在选择培养基上，恒温培养箱中 培养待菌落长出；
[0013] (3)在长出菌落的选择培养基中挑取单菌落一满环，于5-6ml的富集培养基摇床振 荡过夜培养，摇床条件设置为转速170r/min，温度33°C，待菌液浑浊；
[0014] (4)取步骤(3)中的浑浊菌液，稀释至10'取150-200yL涂布于鉴别培养基上，并用 染色，筛选有透明圈的菌株进行平板划线分离，并提纯。
[0015] 所述步骤（1)中马尾藻与陈海水的加入量配比为lg: 10ml;恒温培养温度为33°C， 时间为10天。
[0016] 所述步骤(2)中的选择培养基中添加的组分包括纤维素粉、氯化钠、磷酸二氢钾、 七水合硫酸镁、酵母粉、琼脂粉以及自然海水，各组分加入的配比依次为8.0g:0.5g :1.0g: 0?5g:0?lg:1?8g:1000ml。
[0017] 所述步骤(3)中富集培养基中添加的组分包括纤维素粉、马尾藻粉、硝酸钠、氯化 钾、磷酸二氢钠、七水合硫酸镁、酵母粉、水解酪素以及海水，各组分加入的配比依次为 1?0g:5?0g:1?0g:0?5g:0?5g:0?5g:0?5g:0?lg:1000ml。
[0018] 所述步骤(4)中鉴别培养基中添加的组分羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾、酵母粉、 琼脂粉、自然海水，各组分加入的配比依次为5.0g: 0.25g: 1.0g: 1.0g: 1000ml。
[0019]所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法为：
[0020] (a)将曲霉菌F菌株在Martin液体培养基中振荡培养12-18小时，取2-4ml菌液于已 灭菌的纤维素诱导培液体养基中，恒温摇床振荡培养4-6天；
[0021] (b)将步骤(a)中的纤维素诱导液体培养基，低温离心处理，取上清液为粗酶液；
[0022] (c)将马尾藻粉溶于2-4%的硫酸中，制成马尾藻液，高压灭菌后，用PH值调节液调 至中性，然后加入(b)中的粗酶液，36-40 °C条件下反应48-60小时。
[0023]在步骤(a)中的纤维素诱导培液体养基组分为马尾藻粉、葡萄糖、蛋白胨、七水合 硫酸镁、磷酸二氢钾、1 %孟加拉红水、1 %链霉素液、蒸馏水，各组分比例依次为7.2-8.8g: 1?8-2?2g:4?5-5?5g:0?45-0?55g:lg:3-3?6ml:2?7-3?3ml:900-1100ml。
[0024]所述步骤(a)中的恒温摇床转速为150r/min，温度为33°C。
[0025] 在步骤（b)中低温离心处理的温度为4-5°C，转速3000-5000r/min，时间为8-12min〇
[0026]在步骤（c)中，所述硫酸的浓度为2%，马尾藻粉与硫酸的质量体积比为2_4g: 20ml 〇
[0027] 在步骤(c)中，高压灭菌为121°C，时间为30min，PH值调节液为氢氧化钠溶液。
[0028] 在步骤（c)中，马尾藻粉与粗酶液的加入量配比为l_2g: 10ml。优选比例为1.5g: 10ml 〇
[0029]本发明筛选得到的菌株为曲霉Aspergilus sp.，该菌株于2015年11月30日保藏中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 保藏号CGMCC从).1176，其几3序列，如下：

[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 1、本发明提供的曲霉菌F菌株可分泌纤维素酶，而且在应用时，利用马尾藻粉作为 纤维素底物诱导产酶，直接将该菌株的酶解系统与马尾藻藻体纤维素直接作用，能有效酶 解马尾藻中的纤维素物质，将其降解为还原糖等单糖物质，为生物乙醇的发酵直接提供发 酵底物。
[0033] 2、本发明将难以利用的纤维素物质进行生物乙醇的生产，设备简单，反应温和，操 作简便，适合大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
[0035]自然海水为上海市金山区城市沙滩海域采集并用0.22um滤膜过滤后的备用海水。
[0036]下面结合实例，对本发明作进一步说明：
[0037]自然海水为上海市金山区城市沙滩海域采集回，用0.22um滤膜过滤后的备用海 水。
[0038] 实施例1
[0039] 曲霉菌F菌株的筛选
[0040] 在马尾藻生长的海域及底泥中，采样带回，采样点为浙江舟山海域，采集后立即低 温运回实验室进行筛选。
[0041 ] (1)称取20g新鲜马尾藻于500ml烧杯中，加入200ml自然海水，用八层纱布扎住封 口，外加一层锡箱纸，于恒温培养箱中自然腐烂，温度为30°C，时间为10天。
[0042] (2)吸取自然腐烂的马尾藻液，用无菌水进行梯度稀释，取稀释度为10-6马尾藻液 150ul，在选择培养基平板上涂布。
[0043]其中选择培养基为
[0044] 纤维素粉8.0g
[0045] 氯化钠 0.5g [0046] 磷酸二氢钾l.Og [0047] 七水合硫酸镁0.5g
[0048]酵母粉 O.lg
[0049] 琼脂粉 1.8g
[0050] 自然海水1000ml
[0051] (3)在选择培养基平板中挑取单菌落，于富集培养基中振荡过夜培养，摇床条件设 置为转速170r/min，温度33°C，待菌液浑浊；
[0052]其中富集培养基为:纤维素粉1.0g [0053]马尾藻粉5.0g [0054]硝酸钠 l.Og
[0055] 氯化钾 0.5g
[0056] 磷酸二氢钠0.5g [0057] 七水合硫酸镁0.5g
[0058]酵母粉 0.5g [0059] 水解酪素O.lg
[0060] 自然海水1000ml
[0061] (4)将富集培养基中浑浊的菌液进行稀释：10-1，10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,将 稀释度为10-6的菌液150ul，涂布在鉴别培养基平板上，于恒温培养箱中33°C培养3天。 [0062]其中鉴别培养基为:羧甲基纤维素钠5.0g
[0063] 磷酸二氢钾0.25g
[0064] 酵母粉 l.Og
[0065] 琼脂粉 l.Og
[0066] 自然海水1000ml
[0067]在长出菌落的鉴别培养基上添加1 %的刚果红溶液，15min后倒去染液，滴加lmol/ L的氯化钠溶液5-6滴，洗去多余刚果红，15min后倒去氯化钠溶液，观察透明圈，测量水解圈 的直径，挑选透明圈大的菌株，进行多次平板划线分离，最终得到纯菌株。
[0068] 实施例2 [0069]粗酶液的制取
[0070] (1)将实施例1中得到的曲霉菌F菌株培养在Martin液体培养基中，18小时摇床过 夜培养后，取3ml于已灭菌的纤维素诱导液体培养基中，33°C，150r/min培养5天。取纤维素 诱导培养后的液体，经冷冻离心机离心后取上清液，即为粗酶液。
[0071] 其中纤维素诱导培养基为：
[0072]马尾藻粉8.0g
[0073]葡萄糖 2.0g [0074]蛋白胨 5.0g [0075] 七水合硫酸镁0.5g
[0076] 磷酸二氢钾l.Og [0077] 1 %孟加拉红水3.3ml
[0078] 1%链霉素液3ml
[0079] 蒸馏水 1000ml
[0080] (2)其中，低温冷冻离心机的条件为温度4°C，转速4000r/min，离心时间10min。
[0081] (3)步骤(2)中，F菌株纤维素液体诱导培养后的酶解液，经低温离心所取得的上清 液，即为F菌株所产的粗酶液。
[0082] 实施例3
[0083]粗酶液酶活的测定
[0084] (1)粗酶液的获得同实施例2。
[0085] (2)滤纸酶活(FPA)测定:将滤纸剪成长方形纸条，长约5cm，宽约1.5cm，放进25mL 比色管内，加入lmL柠檬酸缓冲液(pH=4.8)，再加入2mL所制得的粗酶液，使滤纸完全浸泡 在溶液中，50°C准确保温lh后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为14.32U/mL。
[0086] (3)CMC酶活测定:吸取所制得的粗酶液于25mL比色管中，加入lmL含0.5%CMC-Na 的柠檬酸缓冲液(pH = 4.4)，50°C准确保温30min后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为 21.97U/mL〇
[0087] 实施例4
[0088]粗酶液酶活的测定
[0089] (1)粗酶液的获得同实施例2。
[0090] (2)滤纸酶活(FPA)测定:将滤纸剪成长方形纸条，长约5cm，宽约1.5cm，放进25mL 比色管内，加入lmL柠檬酸缓冲液(pH=4.8)，再加入2mL所制得的粗酶液，使滤纸完全浸泡 在溶液中，50°C准确保温lh后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为11.68U/mL。
[0091] (3)CMC酶活测定:吸取所制得的粗酶液于25mL比色管中，加入lmL含0.5%CMC-Na 的柠檬酸缓冲液(pH = 4.4)，50°C准确保温30min后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为 19.99U/mL〇 [0092] 实施例5
[0093]粗酶液对马尾藻的酶解应用
[0094] (1)以浙江舟山海域马尾藻为藻样，采回后，用海水清洗除去贝壳、沙石杂藻等3-4 遍，阳光下晾干，并用粉碎机粉碎lmin，过80目筛，存于阴凉处备用。
[0095] (2)称取30g干燥的马尾藻粉末于250ml三角瓶中，2%硫酸高压灭菌处理后，调pH 至中性。马尾藻粉与2%硫酸的加入配比为3g:20mL，粗酶液用本实施例2中所制得的粗酶 液，2 %硫酸处理后的马尾藻液与粗酶液的配比为lml: lml，37 °C反应48h后，按DNS法检测还 原糖，测得还原糖得率为6.92%，说明粗酶液对马尾藻藻体中纤维素类物质有很好地降解 作用，可将纤维素降解为还原糖，为马尾藻制取生物乙醇做好了准备。
[0096] 实施例6
[0097]粗酶液对马尾藻的酶解应用
[0098] (1)以浙江舟山海域马尾藻为藻样，采回后，用海水清洗除去贝壳、沙石杂藻等3-4 遍，阳光下晾干，并用粉碎机粉碎lmin，过80目筛，存于阴凉处备用。
[0099] (2)称取30g干燥的马尾藻粉末于250ml三角瓶中，2%硫酸高压灭菌处理后，调pH 至中性。马尾藻粉与2%硫酸的加入配比为3g:20mL，粗酶液用本实施例2中所制得的粗酶 液，2 %硫酸处理后的马尾藻液与粗酶液的配比为lml: lml，37 °C反应48h后，按DNS法检测还 原糖，测得还原糖得率为7.37%，说明粗酶液对马尾藻藻体中纤维素类物质有很好地降解 作用，可将纤维素降解为还原糖，为马尾藻制取生物乙醇做好了准备。
【主权项】
1. 一种曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)，其特征在于:保藏号为CGMCC NO. 1176。2. 如权利要求1所述的曲霉菌F菌株(Aspergi 1 lus sp.)的筛选方法，其步骤包括： (1) 称取新鲜瓦式马尾藻于烧杯中，加入陈海水，用八层纱布扎住封口，外加一层锡箱 纸，于恒温培养箱中培养，直至马尾藻腐烂； (2) 将步骤（1)中的腐烂马尾藻液体，稀释后涂布在选择培养基上，恒温培养箱中培养 待菌落长出； (3) 在长出菌落的选择培养基中挑取单菌落一满环，于5-6ml的富集培养基摇床振荡过 夜培养，摇床条件设置为转速170r/min，温度33°C，待菌液浑浊； (4) 取步骤(3)中的浑浊菌液，稀释至10-6,取150-200yL涂布于鉴别培养基上，并用染 色，筛选有透明圈的菌株进行平板划线分离，并提纯。3. 根据权利要求2中所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)的筛选方法，其特征在于 所述步骤（1)中马尾藻与陈海水的加入量配比为lg: l〇ml;恒温培养温度为33°C，时间为10 天。4. 如权利要求1所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp .)降解瓦式马尾藻的应用方法 为： (a) 将曲霉菌F菌株在Martin液体培养基中振荡培养12-18小时，取2-4ml菌液于已灭菌 的纤维素诱导培液体养基中，恒温摇床振荡培养4-6天； (b) 将步骤(a)中的纤维素诱导液体培养基，低温离心处理，取上清液为粗酶液； (c) 将马尾藻粉溶于2-4%的硫酸中，制成马尾藻液，高压灭菌后，用PH值调节液调至中 性，然后加入(b)中的粗酶液，36-40 °C条件下反应48-60小时。5. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于:在步骤(a)中的纤维素诱导培液体养基组分为马尾藻粉、葡萄糖、蛋白胨、七水 合硫酸镁、磷酸二氢钾、1 %孟加拉红水、1 %链霉素液、蒸馏水，各组分比例依次为7.2-8·8g:1·8-2·2g:4·5-5·5g:0·45-0·55g:lg:3-3·6ml:2·7-3·3ml:900-1100ml。6. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于:所述步骤(a)中的恒温摇床转速为150r/min，温度为33°C。7. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于：在步骤(b)中低温离心处理的温度为4-5°C，转速3000-5000r/min，时间为8-12min〇8. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于:在步骤(c)中，硫酸的浓度为2%，马尾藻粉与硫酸的加入量配比为2-4g:20ml。9. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于:在步骤(c)中，高压灭菌为121°C，时间为30min，PH值调节液为氢氧化钠溶液。10. 根据权利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式马尾藻的应用方法， 其特征在于:在步骤(c)中，马尾藻粉与粗酶液的加入量配比为l-2g: 10ml。
【文档编号】C12N1/02GK105820957SQ201511007615
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月29日
【发明人】王淑贤, 何培民, 贾睿, 韦章良, 丁平真, 刘伟
【申请人】上海海洋大学