嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了五种辅酶偏好性翻转后的<i>meso</i>-二氨基庚二酸脱氢酶突变体。所用模板酶为来源于嗜热共生杆菌（<i>Symbiobacterium thermophilum</i>）的NADP（H）依赖型<i>meso</i>-二氨基庚二酸脱氢酶(StDapdh)，酶突变后其特征在于：将同源性比较相当于模板酶的35位的氨基酸残基替换为谷氨酸，即R35E；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为谷氨酸及缬氨酸即R35E/R36V；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为天冬氨酸及缬氨酸即R35D/R36V；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为天冬氨酸及谷氨酰胺即R35D/R36Q；将同源性比较相当于StDapdh的35位、36位、76位的氨基酸残基分别替换为谷氨酸、缬氨酸、缬氨酸即R35E/R36V/Y76V；这些突变体酶，辅酶偏好性均由NADP（H）突变为NAD(H)。
【专利说明】
嗜热共生杆菌二氨基庚二酸脱氢酶突变体
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种对生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶 的辅酶偏好性改造，并获得使二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性从NADP (H)变为 NAD (H)的突变体。
【背景技术】
[0002] D-氨基酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，在食品、化妆品和制药 工业广泛应用（王颖，李云政，iT尹众了2003，」以58-60.)。已知的D-氨基酸脱氢酶 多为膜蛋白（Tanigawa M.，Shinohara T.，et aJ, Jciofe 2010，激，247-255; Xu S. J. , Ju J. S. , Ma Y. H. , Wei Sheng Wu Xue Bao 2007, 47, 634-638; Jones H., Venables ff. A., Biochimie\99>?>, 65, 177-183; Jones H. , Venables ff. A., FEES Lett. 1983, 151, 189-192; Wild J. , Obrepalska B. , Mol. Gen. Gent. 1982, 186, 405-410; Wild J. , Klopotowski T. , Mol. Gen. Gent 1981, 181, 373-378; Olsiewski P. J.，Kaczorowski G. J.，Walsh C.，J；1980，之55； 4487-4494.)，不 能被用于工业生产，仅有二氨基庚二酸脱氢酶（DAPDH) (EC 1. 4. 1. 16)及其突变体 可用来进行 D-氨基酸的生物合成（Misono H.，Soda K.，JoyraaJ CAev??. 1980， 255, 10599-10605; Vedha-Peters K. , Gunawardana M. , Rozzell J. D. , Novick S. J., J. Am. n Chem. Soc. 2006, 128, 10923-10929; Akita H. , Doi K. , Kawarabayasi Y., Ohshima T. , Biotechnol. Lett. 2012, 34, 1693-1699; Akita H. , Suzuki H., Doi K., OhshimaT., ificraAioZ 价okcA 2013，你,1135-1143.)。在辅酶偏好性方面， 已知的DAPDH酶及突变体的辅酶偏好性均为NADP (H)，到目前为止也没有DAPDH家族酶辅 酶偏好性改造的研究报道。相比与辅酶NADP (H)，辅酶NAD (H)有更好的稳定性，更低廉的 价格及更广的辅酶循环方法，NAD(H)依赖型氨基酸脱氢酶可使用甲酸脱氢酶（FDH)以及甲 酸氨作为辅酶循环体系，而NADP(H)依赖型氨基酸脱氢酶则主要使用葡萄糖脱氢酶（GDH) 以及葡萄糖作为辅酶循环体系。氨基酸脱氢酶需要碱性pH条件进行催化反应，GDH循环体 系中使用葡萄糖作为底物，循环生成的葡萄糖酸会降低体系的pH值，影响反应的进程，且 不易除去，还需另外添加反应所需的铵盐，这些额外成分将增加后续分离工艺难度；FDH循 环体系可以使用甲酸氨作为共底物，其中氨直接参与合成，而甲酸被氧化成易挥发除去的 C0 2，反应液中没有额外杂质，将极大简化后续产物的分离纯化过程，在使用氨基酸脱氢酶 合成氨基酸的过程中，使用NAD(H)作辅酶以及FDH做循环系统将更有应用优势。因此，获 得NAD(H)依赖型的D-氨基酸脱氢酶是非常重要的。
[0003] 我们从嗜热共生杆菌中获得了能够还原氨化 合成 D-丙氨酸的氨基酸脱氢酶 StDapdh (Gao X.，Chen X.，Liu W.，Feng J.，Wu Q.， HuaL.，ZhuD.，々炉丄办Kiiw?. ificraAioZ 2012，7戌 8595-8600)，该酶可以被直接 用来进行D-氨基酸的合成(专利申请号：201210334554. 6)，在获得X-射线晶体结构（Liu ff. , Li Z. , Huang C. H. , Guo R. T. , Zhao L. , Zhang D. , Chen X. , Wu Q. , Zhu D., 75； 217-222)、通过改造扩增其底物谱至亮氨酸以及苯丙氨酸（Gao X., Huang F., Feng J., Chen X., Zhang H., Wang Z. , ffu Q., Zhu D. , Appl. Environ. 2013)以及更大位阻的氨基酸如叔亮氨酸(专利申请号：201310459718. 2)等工 作的基础上，获得了辅酶偏好性为NAD (H)依赖型的突变子，将能进一步增加该酶实际应用 的可行性。
【发明内容】
[0004] 本发明是对生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性改造，并获得使 二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性从NADP(H)变为NAD(H)的突变体。
[0005] 本发明中所用生物催化剂，StDapdh突变体的获取步骤如下： 1?以pET32_StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引 入R35E单位点突变； 2?以pET32_StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引 入R35E/R36V两位点组合突变； 3?以pET32_StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引 入R3OT/R36V两位点组合突变； 4?以pET32_StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引 入R3OT/R36Q两位点组合突变； 5?以pET32_StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引 入R3OT/R36Q/Y76V三位点组合突变； 6. 对所构建的工程菌进行培养、诱导表达，突变体蛋白大多以可溶性形式存在于胞 内； 7. 通过Ni-NTA将该突变体蛋白纯化。
[0006] 本发明具有如下优点： 本发明方法以NADP(H)依赖型氨基酸脱氢酶StDapdh出发，获得了其辅酶偏好性翻转 为NAD (H)依赖型的突变子酶。
[0007]
【附图说明】： 附图1 :相应StDapdh突变子蛋白纯化SDS-PAGE电泳图谱。图中，泳道M :蛋白质分 子量Marker,泳道1为野生型酶，泳道2-6为纯化后五个的突变子酶：R35E，R35E/R36V， R3OT/R36V，R3OT/R36Q，R35E/R36V/Y76V。
[0008]
【具体实施方式】
[0009] 以下通过具体的实施例来进一步说明本
【发明内容】
，但是这些实施例不构成对本发 明的限制。下列实例中所用材料除特别说明外，所用化学药品、试剂均购自Sigma公司。DNA 和蛋白质Marker均购自Fermentas公司，蛋白纯化Ni-NTA填料购自GE。Quick Change Mutagenesis Kit购自Agilent公司，突变引物按照试剂盒要求进行设计。引物合成、DNA 序列测定均由金维治公司（北京）进行，PET32质粒载体，T0P10、BL21 (DE3)高效感受态购自 Novagen。液相色谱分析使用Agilent-1200色谱仪，色谱柱为Eclipse )(DB-C18柱（4.6 X 150 mm)〇
[0010] 实施例1:基因突变 所用S故耶〇%基因Genbank号为AP006840. 1，先将该基因全合成并连接到pET32载体 上获得质粒：PET32-S故耶〇%，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中对野生型基因进行可溶表达，表 达出的蛋白N-端带有6*his tag。根据需要突变的位点，参照Quick Change Mutagenesis Kit试剂盒使用说明，合成表1中所用PCR突变引物，从野生型菌种提出质粒DNA，以其为模 板进行PCR产物扩增，对扩增出来的PCR产物进行Dpnl切割，切割后进行核酸回收并转化 T0P10感受态，挑取单菌落送样测序，对于测序正确的样品，转化BL21菌株。
[0011] 表1:突变PCR引物
以故3/70%质粒为模板，使用引物1和2在质粒上引入R35E单突变，并将突变 后产物转化至大肠杆菌T0P10感受态，提取质粒并测序验证，将测序正确的质粒转化入大 肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得表达菌株。分别使用引物3和4, 5和6, 7和8,重复上述 步骤，获得R35E/R36V，R3OT/R36V以及R3OT/R36Q三个双突变菌株；以R35E/R36V为模板， 使用引物9和10,获得R35E/R36V/Y76V三突变菌株。
[0012] 实施例2:突变体酶的表达、初步纯化 将实施例1中获得的突变体菌株分别于2 L LB液体培养基中进行培养，先于37°C培 养至〇D6。。约0. 8后，加入终浓度0. 5 mM的异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)进行 诱导表达，诱导温度为25°C，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于5000 rpm离心5分 钟收集菌体，利用缓冲液A (20 mM Tris-Cl pH 8.0,50 mM氯化钠）重悬并洗涤菌体，并再 次离心菌体。后续所有纯化实验均在4°C进行，所有缓冲液均先预冷至4°C。将洗涤后的菌 体用100 mL缓冲液A重悬菌体，高压匀浆破碎，14000 rpm离心30分钟去除破碎沉淀，上 清上样用缓冲液A平衡过的Ni-NTA层析柱，并用缓冲液B (20 mM Tris-Cl pH 8.0，50mM 咪唑，500 mM氯化钠)去除杂蛋白，用缓冲液C(20 mM Tris-Cl pH 8. 0，250mM咪唑，500 mM氯化钠）洗脱出目的蛋白。将目的蛋白对缓冲液D (20 mM Tris-Cl pH 8.0，50 mM氯 化钠）进行透析，以去除高浓度咪唑以及氯化钠。附图1为纯化后的突变子蛋白电泳图谱。
[0013] 实施例3:突变体的活力测定 突变子的活力利用SPECTRAMAXM2e (MD，USA)酶标仪进行测定，所用测活体系如下：各 成分的终浓度分别为：20 mM底物丙酮酸，200 mM底物氯化铵，1 mM辅酶NADH (或NADPH)， 适量StDapdh突变体纯酶，测活缓冲液为100 mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液pH 9. 0,最终 体积200 ML。底物以及蛋白样品均先加入96孔板中于30° C平衡10分钟，再向其中添加 辅酶NADH起始反应，通过测量340 nm处吸光度的减少来测定酶活力（NADH在340 nm摩尔 消光系数为6. 22 mM ~ cm ^，酶活力单位定义为催化反应时每分钟消耗1 Mmol辅酶NADH 所需的酶量，表2为野生型酶以及突变子酶对NADH以及NADPH的比活力，从表中可以看出， 所有突变体的辅酶偏好性均从野生型酶的NADP(H)翻转为NAD (H)依赖型。
[0014] 表2野生型酶和突变体对NADH以及NADPH的比酶活
【主权项】
1. 五种NAD (Η)依赖型氨基酸脱氢酶突变体，可以作为生物催化剂。2. 包括：利用来源于嗜热共生杆菌（的NADP (Η)依 赖型氨基酸脱氢酶StDapdh作为模板，通过分子生物学技术进行突变获得NAD (Η)依赖型 的氨基酸脱氢酶突变体。3. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白特征在于， 突变体模板为嗜热共生杆菌（的azeso-二氨基庚二酸脱 氢酶或者是与其氨基酸序列相似度不低于80%的蛋白质。4. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征 在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R)替换为谷氨酸（E)，即R35E。5. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征 在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R)替换为谷氨酸（E);将同源性比较 相当于StDapdh第36位的精氨酸（R)替换为缬氨酸（V)，即R35E/R36V。6. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征 在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R)替换为天冬氨酸（D);将同源性比 较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R)替换为缬氨酸（V)，即R3OT/R36V。7. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征 在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R)替换为天冬氨酸（D);将同源性比 较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R)替换为谷氨酰胺（Q)，即R3OT/R36Q。8. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征 在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R)替换为谷氨酸（E);将同源性比较 相当于StDapdh第36位的精氨酸（R)替换为缬氨酸（V);将同源性比较相当于StDapdh第 76位的酪氨酸（Y)替换为缬氨酸（V)，即R35E/R36V/Y76V。9. 如权利要求1所述生物催化剂二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其辅酶偏好性从 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH或NADP+)变为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH或NAD+)。
【文档编号】C12R1/01GK105821014SQ201510006413
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】刘卫东, 陈曦, 赵雷明, 李键煚, 冯进辉, 吴洽庆, 朱敦明, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所