一种改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法，属于脂肪酶制备领域。本发明以竹笋为原料，经酸溶酶解制得竹笋纤维，再用氢氧化钠碱化，过氧化氢和铜的催化作用下氧化改性其表面基团，最终浸渍并真空冻干固化，从而得到改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法。本发明方法独特新颖，制备过程简单易行，不仅利用纤维素的空间结构和柔性，并有大量的自由羟基，经改性后与酶蛋白分子中的氨基、巯基、咪唑基、吲哚基等官能团共价结合，具有极佳的相容性，而且不影响酶的活性和反应能力，提高了酶的结合率和比活力，具有巨大的结合容量，适合大规模推广应用。
【专利说明】
一种改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法，属于脂肪酶制备领域。
【背景技术】
[0002]酶作为一种生物催化剂，与化学催化相比，具有反应条件温和、生物可降解性、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。酶的化学本质是蛋白质，其催化特性严格依赖于蛋白质的三维结构以及底物与蛋白质活性基团准确的功能定位。游离酶通常存活温度、pH值范围窄，容易变性和失活，难以重复使用，不能实现连续操作。对于现代工业而言，游离酶不是一种理想的催化剂，因而较大地限制了酶的应用。酶经固定化后，简化提纯工艺，易于实现连续反应和自动化生产，实现重复使用，提高利用率，降低成本等。脂肪酶作为酶的一种。
[0003]脂肪酶由于其在诸如相对较高的温度、有机溶剂等不利的条件下也能保持其高度的活性，在有机合成中有巨大的利用价值，与其它酶相比，脂肪酶的底物特异性相对来说不是太严格，所以脂肪酶被广泛使用。脂肪酶的应用包括油脂水解、食品风味和香味的改进、食品添加剂的生产、手性中间体的生产和药物产品的生产、皮革絹纺脱脂、低等油脂的改性、添加于洗涤剂和化妆品中等。因此，脂肪酶作为工业催化剂有巨大地潜力。
[0004]人们将脂肪酶固定在载体上以克服游离脂肪酶操作稳定性差、易失活、不易重复使用、分离纯化操作复杂的缺点，固定化酶与游离酶相比稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产。因此获得性能优异的固定化脂肪酶对实现工业环境下高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。
[0005]但目前，常用的固定化方法中大都通过将脂肪酶固定在成本高昂不溶性聚合物或无机载体上，载体的存在会“稀释”脂肪酶的活性(在整个固定化酶重量中，载体一般占90%以上)，降低脂肪酶的结合容量和反应能力，同时，由于脂肪酶具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对脂肪酶的空间结构或活性中心造成不可逆的破坏，使得脂肪酶活力下降、或失活，严重影响了固定化脂肪酶的效果和催化效率。
【发明内容】
[0006]本发明主要解决的技术问题:针对目前常常直接用游离的脂肪酶作催化剂，其存在操作稳定性差、易失活、不易重复使用、分离纯化操作复杂，而传统的固定化脂肪酶的固定化方法中大都通过将脂肪酶固定在成本高昂不溶性聚合物或无机载体上，载体的存在会“稀释”脂肪酶的活性，降低脂肪酶的结合容量和反应能力的缺陷，提供了一种以竹笋为原料，经酸溶酶解制得竹笋纤维，再用氢氧化钠碱化，过氧化氢和铜的催化作用下氧化改性其表面基团，最终浸渍并真空冻干固化，从而得到改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法。该方法独特新颖，制备过程简单易行，不仅利用纤维素的空间结构和柔性，并有大量的自由羟基，经改性后与酶蛋白分子中的氨基、巯基、咪唑基、吲哚基等官能团共价结合，具有极佳的相容性，而且不影响酶的活性和反应能力，提高了酶的结合率和比活力，且具有巨大的结合容量，适合大规模推广应用。
[0007 ]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取I?2kg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为3?5mm的小块，放入烘箱中在105?110°C下干燥12?15h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末；
(2)将400?500g竹笋粉末倒入其体积5?8倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤3?5遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末；
(3)按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在40?50°C下保温酶解4?6h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为1:1复配制得；
(4)酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以3000?4000r/min转速离心10?15min，分离去除上清液，得到下层竹笋纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积2?3倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应I?2h后过滤干燥，得到碱化竹笋纤维素；
(5)将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗5?1min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根3?5cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒3?5h，得到改性竹笋纤维素；
(6)将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积2?3倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于4?6°C下超声振荡浸渍6?Sh后保温固定16?18h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
[0008]本发明的应用方法是:在酿酒过程中，向白酒中加入本发明制得的改性纤维素固定化脂肪酶，其中加入量为每I?3L白酒中加入2?4g，充分混合均匀，即可，不仅可以提高白酒中脂类香味物质含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，而且可以缩短贮存老熟时间，使得贮存老熟时间从原有的20?22天缩短至10?15天，制得的白酒酒品率提高了35%以上。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简单易行，操作条件温和，固定化中酶活损失少，活性回收率高，具有较好的催化活性，可以广泛推广使用；
(2)本发明方法独特新颖，利用纤维素的空间结构和柔性，并有大量的自由羟基，经改性后与酶蛋白分子中的氨基、巯基、咪唑基、吲哚基等官能团共价结合，具有极佳的相容性，而且不影响酶的活性和反应能力，且具有巨大的结合容量，为普通固定化脂肪酶载体结合容量的3?5倍。
【具体实施方式】
[0010]首先称取I?2kg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为3?5mm的小块，放入烘箱中在105?110°C下干燥12?15h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末;然后将400?500g竹笋粉末倒入其体积5?8倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤3?5遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末；随后按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在40?500C下保温酶解4?6h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为I:I复配制得；酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以3000?4000r/min转速离心10?15min，分离去除上清液，得到下层竹笋纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积2?3倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应I?2h后过滤干燥，得到碱化竹舆纤维素;接下来将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗5?1min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根3?5cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒3?5h，得到改性竹笋纤维素;最后将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积2?3倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于4?6°C下超声振荡浸渍6?Sh后保温固定16?18h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
[0011]实例I
首先称取Ikg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为3mm的小块，放入烘箱中在105°C下干燥12h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末;然后将400g竹笋粉末倒入其体积5倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤3遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末；随后按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积3倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在40°C下保温酶解4h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为1:1复配制得;酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以3000r/min转速离心lOmin，分离去除上清液，得到下层竹笋纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积2倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应Ih后过滤干燥，得到碱化竹笋纤维素;接下来将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗5min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根3cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒3h，得到改性竹笋纤维素;最后将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积2倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于4°C下超声振荡浸渍6h后保温固定16h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
[0012]本实例操作简单易行，在酿酒过程中，向白酒中加入本发明制得的改性纤维素固定化脂肪酶，其中加入量为每IL白酒中加入2g，充分混合均匀，即可，不仅可以提高白酒中脂类香味物质含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，而且可以缩短贮存老熟时间，使得贮存老熟时间从原有的20天缩短至10天，制得的白酒酒品率提高了 35%。
[0013]实例2
首先称取1.5kg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为4mm的小块，放入烘箱中在108°C下干燥14h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末;然后将450g竹笋粉末倒入其体积7倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤4遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末；随后按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积4倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在45 °C下保温酶解5h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为1:1复配制得;酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以3500r/min转速离心13min，分离去除上清液，得到下层竹舆纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积2.5倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应
1.5h后过滤干燥，得到碱化竹笋纤维素;接下来将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗8min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根4cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒4h，得到改性竹笋纤维素;最后将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积2.5倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于5°C下超声振荡浸渍7h后保温固定17h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
[0014]本实例操作简单易行，在酿酒过程中，向白酒中加入本发明制得的改性纤维素固定化脂肪酶，其中加入量为每2L白酒中加入3g，充分混合均匀，即可，不仅可以提高白酒中脂类香味物质含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，而且可以缩短贮存老熟时间，使得贮存老熟时间从原有的21天缩短至13天，制得的白酒酒品率提高了 38%。
[0015]实例3
首先称取2kg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为5mm的小块，放入烘箱中在110°C下干燥15h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末;然后将500g竹笋粉末倒入其体积8倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤5遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末；随后按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积5倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在50°C下保温酶解6h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为1:1复配制得;酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以4000r/min转速离心15min，分离去除上清液，得到下层竹笋纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积3倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应2h后过滤干燥，得到碱化竹笋纤维素;接下来将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗1min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根5cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒5h，得到改性竹笋纤维素;最后将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积3倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于6°C下超声振荡浸渍Sh后保温固定18h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
[0016]本实例操作简单易行，在酿酒过程中，向白酒中加入本发明制得的改性纤维素固定化脂肪酶，其中加入量为每3L白酒中加入4g，充分混合均匀，即可，不仅可以提高白酒中脂类香味物质含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，而且可以缩短贮存老熟时间，使得贮存老熟时间从原有的22天缩短至15天，制得的白酒酒品率提高了 40%。
【主权项】
1.一种改性纤维素固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)称取I?2kg竹笋，剥皮取笋芯切成粒径为3?5mm的小块，放入烘箱中在105?110°C下干燥12?15h，将干燥后的笋块放入气流粉碎机中粉碎并过100目标准筛，得到竹笋粉末； (2)将400?500g竹笋粉末倒入其体积5?8倍浓度为0.lmol/L盐酸溶液中，放置在摇床上振荡浸渍过夜，去除酸溶性杂质并转入布氏漏斗，用去离子水抽滤洗涤3?5遍，自然风干得到预处理后的竹笋粉末； (3)按质量比为100:1将上述预处理后的竹笋粉末和复合酶制剂一起装入陶瓷发酵罐中，再加入两者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后放入恒温箱，在40?50°C下保温酶解4?6h，其中复合酶制剂是由淀粉酶和中性蛋白酶按质量比为1:1复配制得； (4)酶解结束后，将酶解液移入卧式离心机，以3000?4000r/min转速离心10?15min，分离去除上清液，得到下层竹笋纤维素沉淀，将分离得到的竹笋纤维素倒入其体积2?3倍浓度为0.05mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌碱化反应I?2h后过滤干燥，得到碱化竹笋纤维素； (5)将上述制得的碱化竹笋纤维素分别用质量浓度为30%过氧化氢溶液和质量浓度为10%尿素溶液持续冲洗5?1min后迅速放入三口烧瓶中，向瓶中加入一根3?5cm长的铜丝后以5mL/min速率通入氧气直至置换出瓶中所有空气，再用保鲜膜密封瓶口，于烈日下曝晒3?5h，得到改性竹笋纤维素； (6)将上述制得的改性竹笋纤维素浸入其体积2?3倍浓度为15g/L脂肪酶溶液中，放入超声振荡仪于4?6°C下超声振荡浸渍6?Sh后保温固定16?18h，过滤将滤渣放入真空冻干机中干燥，即得改性纤维素固定化脂肪酶。
【文档编号】C12N11/12GK105821028SQ201610267293
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】郭伟明, 张明, 林茂平
【申请人】常州市好利莱光电科技有限公司