柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Et STK）基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为Et STK基因，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。同时提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et STK的成熟肽与大肠杆菌或毕赤酵母细胞的表达载体相连获重组表达载体，再将重组表达载体转入大肠杆菌或毕赤酵母细胞宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即得防治鸡球虫病的疫苗，具有很高的应用价值。
【专利说明】
柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Et STK)基因及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因及其应 用。
【背景技术】
[0002] 鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生 虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨 大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它主 要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的 死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要以在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗球 虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使用 一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失 效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。同 时因球虫产生耐药性，使好不容易筛选出来的抗球虫药使用年限大大缩减，新药开发速度 已赶不上耐药株出现的速度。而且抗球虫药作为饲料添加剂的潜在危害又逐渐成为人们关 注的对象，食品安全日益受到关注，很多曾经效果很好的抗球虫药都被划入禁用之列，因 此，人们期待用更理想的方法来替代抗球虫药物的使用。球虫活卵囊疫苗的成功研制和应 用提供了一种可以替代药物控制鸡球虫病的技术手段。但活疫苗不可避免地存在难保存、 散毒及潜在的致病威胁等缺点，未能在鸡场得到广泛使用，所以迫切需要寻找新的防治手 段来控制鸡球虫病。而研制新疫苗和新药物的关键在于寻找到合适的虫体抗原基因或基因 产物作为防治球虫病的作用靶标。
[0003] 鸡球虫是属于顶复器门（Apicomplexa)艾美耳属(Eimeria)的一类寄生于鸡肠道 的原虫。顶复器原虫多数是专一性的细胞内寄生虫，包括疟原虫（Plasmodium)、弓形虫 (Toxoplasma)、艾美耳球虫（Eimeria)、隐孢子虫（Cryptosporidium)等，有复杂的生活史， 需入侵宿主细胞，完成生活史循环需要更替一个或多个宿主，或更换不同的细胞和组织，因 而成功地入侵宿主细胞是这类寄生虫感染建立的前提。虽然顶复器原虫入侵的宿主细胞不 同，包括红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和消化道细胞等，但都有一个共同的高度保守的入侵 机制，需要顶复器(微线、棒状体和致密颗粒)分泌一系列蛋白参与，这些蛋白相互作用，在 宿主细胞膜与虫体表面形成一个高度保守的运动结构(Moving Junction，MJ)，对虫体入侵 宿主细胞起至关重要的作用。
【发明内容】
[0004]本发明要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和 新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Et STK)基因，该 EtSTK在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫 苗或新药具有很高的应用价值。
[0005]此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0007]在本发明的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为ET STK基因，包 含SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0008] 在本发明的一个方面，利用5'RACE和3'RACE首次扩增了柔嫩艾美耳球虫Et STK基 因的全长序列，如SEQ ID N0.2所示。该序列全长1799bp，除了0RF( 102-1625bp)与NCBI中柔 嫩艾美耳球虫未知蛋白ZB1-A08100%同源外，该序列还包括5'的UTR序列，长lOlbp，含有 CAAT序列，没有TATA序列；3 '端UTR序列，长174bp，含poly (A)尾，没有典型的AATAAA序列。 5 ' -UTR和3 ' -UTR可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5 ' UTR通过其长度和碱基顺序以及二级结构等来参与表达调控。其中5'-UTR主要参与翻译调 节，影响转录后的各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用;3 '-UTR影响RNA的 水平，从而影响翻译后蛋白的表达量，因此，5 '-UTR和3 '-UTR在真核生物基因的转录、翻译 和表达过程中发挥重要作用。
[0009] 在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，包含编码Et STK蛋白氨基酸序列的 核苷酸序列。
[0010] 所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表 达载体、重组真核表达载体。
[0011] 在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经 表达而制得。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种多克隆抗体，该多克隆抗体是用上述重组蛋 白免疫兔子而制得。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备 预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。
[0014] 优选的，本发明提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法:将柔嫩艾美耳球虫Et STK的成熟肽与真核表达载体相连获重组真核表达质粒，经肌肉注射免疫后，鸡只可获得比 较好的免疫保护力。
[0015] 所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活 史来发挥作用。
[0016] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选 预防或治疗球虫病的药物。
[0017] 在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述重组蛋白，或上述重组载体， 该重组载体为真核表达载体。
[0018] 在本发明的另一方面，还提供了一种作用靶标为EtSTK蛋白的抗球虫药物。
[0019] 本发明柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtSTK基因，是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tene 11a)的一个新基因。Western-blot分析表明本发明EtSTK的原核表达产物和真核表达 产物都具有良好的免疫原性;免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示EtSTK与子孢子 的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的EtSTK基因，为 开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 图1是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因扩增产物电泳鉴定图；
[0022] M:标准DNA分子量(从上到下：2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
[0023] 图2是本发明实施例2实时定量PCR检测EtSTK基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶 段的转录水平图；
[0024]图3是本发明实施例3重组原核表达质粒pCold I-EtSTK的双酶切鉴定图；
[0025] "1"代表重组表达质粒pcold I-EtSTK的BamH I、EcoR I双酶切产物。
[0026]图4是本发明实施例3纯化的EtSTK重组蛋白分析图；
[0027] M:蛋白质标准分子量（从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、 34kDa、26kDa、17kDa); 1:150mmol结合咪唑洗脱EtSTK重组蛋白；2:250mmol结合咪唑洗脱 EtSTK重组蛋白。
[0028]图5是本发明实施例5的EtSTK蛋白免疫原性分析图；
[0029] M:预染的蛋白质标准分子量（从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、 43kDa、34kDa、26kDa、17kDa); 1 :EtSTK免疫兔子的抗血清;2:抗His单克隆抗体;3:兔子阴性 血清。
[0030] 图6是本发明实施例6免疫荧光检测EtSTK蛋白在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的 分布和定位图；
[0031] 图7是本发明实施例7体外抑制试验结果图；
[0032]图8是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK的PCR鉴定和双酶 切鉴定图；
[0033] M:标准DNA分子量（从上到下：2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp); 1:重 组质粒pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK的菌液PCR鉴定结果；2 :重组质粒pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK的 BamH I、EcoR I双酶切产物。
[0034]图9是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-Et STK转染DF-1细胞的 表达结果图；
[0035] A: pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK 转染 DF-1 细胞；B: pcDNA3 ? 1-f lag 转染 DF-1 细胞；C:正常 DF-1细胞。
[0036]图10是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-f lag-EtSTK转染DF-1;细胞表 达后Western-Blot检测结果图。
[0037] M:预染蛋白质分子量标准（从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、55kDa、43kDa、 34kDa、26kDa、17kDa); 1:转染重组质粒 pcDNA3.1-f lag-EtSTK 的 DF-1 细胞；2:转染空载体 pcDNA3.141&8的0卩-1细胞。
[0038]图11是本发明实施例9C0-IP结果图。l:EtSTK多抗结合至protein A+G柱子上捕获 EtSTK与EtAMAl的蛋白互作体，WB所用一抗为抗EtAMAl单抗。2 :抗EtAMAl单抗结合至 proteinA+G柱子上捕获EtSTK与EtAMAl的蛋白互作体，WB所用一抗为抗EtSTK多抗。
[0039]图12是本发明实施例10 GST pull-down的结果图。
[0040] M:预染蛋白质分子量标准（从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、55kDa、43kDa、 34kDa、26kDa、17kDa); 1: input; 2:阴性对照。
【具体实施方式】
[0041 ]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京:科学出版 社，2002)中所述的方法进行。
[0042]本发明以柔嫩艾美耳球虫为研究对象，筛选鉴定参与柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细 胞的相关蛋白。在前期实验室以柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白l(EtAMAl)为诱饵，筛选柔嫩艾 美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库获得可能与之相互作用蛋白的EST序列基础上，选择 编号为STK基因的EST序列，利用RACE(C末端快速扩增)技术扩增获得了含一个完整0RF(开 放阅读框)的基因全长序列，在原核表达系统和真核表达系统中成功表达该基因蛋白，并通 过实验表明对EtSTK与子孢子的入侵相关。
[0043]实施例1柔嫩艾美耳球虫Et STK基因全长eDNA的克隆及分析
[0044] 1.材料
[0045] 虫株和体外培养细胞:柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)是由中国农业科学院上海兽 医研究所保存、繁殖提供。DF-1(鸡胚成纤维细胞)细胞用于感染、抑制、免疫荧光试验和转 染真核表达重组质粒。
[0046] 2 ?方法
[0047] 2.1总1?熟提取
[0048]实验前将干净的金属提取器皿单独使用锡箱纸包好，180°C烤箱内烘烤6h。操作台 和离心管架等均用75%酒精消毒，保证无RNase污染。所用移液枪、枪头和离心管均专一用 于RNA的提取。
[0049] 子孢子总RNA的提取参照Trizol试剂说明书操作，具体详细步骤为：
[0050] 1)取保存于液氮中的E. tenel la子孢子，加入适量Trizol试剂并充分混匀，室温静 置6min〇
[00511 2)向步骤1)中加入氯仿(按lmL Trizol加200此氯仿），盖紧离心管盖，用手颠倒混 匀数次，再室温静置15min。
[0052] 3)4°C 12000r/min 离心 15min。
[0053] 4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的 白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白 色中间层）。
[0054] 5)向上清中加入等体积的异丙醇，颠倒离心管充分混匀后，在15~30°C下静置 10mim〇
[0055] 6)4°C，12000r/min离心 10min，RNA沉于管底。
[0056] 7)小心弃上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇lmL(DEPC水配制），温和振荡沉 淀。
[0057] 8)4°C，12000r/min离心5min后小心弃去乙醇，沉淀室温干燥至无乙醇气味，用少 量DEPC水溶解沉淀。电泳分析，并测定其浓度和分析其纯度。
[0058] 2? 2 RACE扩增cDNA模板的制备：按照GeneRacer?Kit(美国Invitrogen公司）说明 书操作步骤将提取的柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA反转录合成cDNA第一链。
[0059] 2.3柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因的5' RACE扩增
[0060] 5'端RACE引物设计合成：
[0061] 在前期实验室利用柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白l(EtAMAl)为诱饵，筛选柔嫩艾美 耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得可能相互作用蛋白的ESTs序列基础上，本发明选 择其中一个基因的EST序列，该EST序列含3'末端的Ploy(A)尾，Blast分析与柔嫩艾美耳球 虫差异表达基因ZB1-A08同源。利用Primer Premier 5.00软件设计5'端的引物，5'端RACE 扩增引物见下表1。
[0062] 表1 5'端RACE扩增引物序列
[0063]
[0064] 利用此引物扩增5' cDNA末端，将5' RACE PCR扩增产物回收后，与pGEM-T-easy载体 连接，转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑选白色菌落进行PCR鉴定，如果扩增片段与预期一 致，则取500yL菌液送公司测序。对于阳性克隆测序结果，用DNAstar软件查找51ACE扩增产 物序列与原EST序列的重叠部分，拼接获得全长cDNA序列（SEQ ID N0.2)。
[0065] 2.4柔嫩艾美耳球虫财311(基因01^的克隆和分析
[0066]根据拼接的全长cDNA序列设计两端引物（见下表2)，在上下游引物中分别加入酶 切位点BamH I和EcoR I，以RACE扩增时反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。
[0067] 表2 STK基因扩增引物序列
[0068]
[0069] 反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析(见图1)。在图1中，M:标准DNA分子量(从 上到下：200(^口，100(^口，75(^口，50(^口，25(^口，10(^口） ；1:扩增的￡七511(基因。将回收的?0?产 物与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。挑选白色菌落进行PCR鉴定。将鉴定 的阳性菌落送公司测序。测序结果利用常规生物信息学软件对获得的全长cDNA序列及其编 码蛋白结构进行预测分析。
[0070] 结果:根据STK基因EST序列，利用5'RACE技术扩增得了一个含完整开放阅读框的 全长cDNA序列，该序列全长1799bp，包括5 '的UTR序列，长lOlbp，含有CAAT序列，没有TATA序 列；3 '端UTR序列，长174bp，含poly (A)尾，没有典型的AATAAA序列，0RF长1524bp，编码507个 氨基酸，理论分子量为54KDa，预测等电点为8.36。该基因编码蛋白的1-56位氨基酸位于细 胞内部，80-507氨基酸位于细胞膜表面，在57-79位氨基酸间形成一个典型的跨膜旋转区； 无信号肽;可能有24个抗原位点；不具有卷曲螺旋结构；可能含有1个N端糖基化位点，1个 cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点，1个1 11171^81:〇7131:;[011位点，7个蛋白激酶(：磷酸化位点。利用^0程序进行功能保守功能域分析， 发现该基因具有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase，STK) 结构域，故将其命名为柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Eimeria tenella Serine/threonine protein kinase，EtSTK)0
[0071] EtSTK核苷酸序列全长1799bp，除了0RF( 102-1625bp)与NCBI中柔嫩艾美耳球虫未 知蛋白ZB1-A08100%同源外，该序列还包括5'的UTR序列，长lOlbp，含有CAAT序列，没有 TATA序列；3 '端UTR序列，长174bp，含poly (A)尾，没有典型的AATAAA序列。5 ' -UTR和3 ' -UTR 可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5'UTR通过其长度和 碱基顺序以及二级结构等来参与表达调控。其中5'-UTR主要参与翻译调节，影响转录后的 各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用;3 ' -UTR影响RNA的水平，从而影响翻 译后蛋白的表达量，因此，5 ' -UTR和3 ' -UTR在真核生物基因的转录、翻译和表达过程中发挥 重要作用。
[0072]实施例2 Et STK基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达差异分析
[0073]分别提取柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段虫体(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子 和第二代裂殖子）的总RNA，以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代 裂殖子的cDNA第一链为模板，利用实时荧光定量PCR，选择18s rRNA作为内参，验证EtSTK基 因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体中的表达情况。表3为实时荧光定量PCR扩增引物序 列。
[0074]表3实时荧光定量PCR扩增引物序列
[0076]结果表明，EtSTK基因mRNA在柔嫩艾美耳球虫四个发育阶段均有转录，其中，在子 孢子发育阶段的转录水平显著高于其他发育阶段(见图2)。
[0077]实施例3 Et STK基因原核表达重组质粒的构建及重组蛋白的表达
[0078] 将之前测序正确的重组克隆质粒pGEM-T-easy-EtSTK，利用限制性内切酶BamH I 和EcoR I进行双酶切，然后再与用同样限制性内切酶双酶切的原核表达载体pCold I连接， 构建重组表达质粒pCold I-EtSTK。转化大肠杆菌T0P10后，经PCR以及双酶切鉴定，获得与 预期大小一致的目的条带(见图3)，表明含Et STK基因的原核表达质粒构建成功。
[0079] 将构建成功的pCold I-EtSTK重组表达质粒，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在37°C 下经lmmol/L IPTG诱导表达并对其进行SDS-PAGE电泳分析。发现目的条带有表达，大小为 58kDa左右，与预测大小一致(EtSTK预测分子量54kDa，表达的融合蛋白His标签约3.6kDa)。
[0080] 取20mL IPTG诱导表达后的菌液，4°C离心获得菌体沉淀后，加入适量ros缓冲液， 悬浮均匀，经超声裂解后，离心。分别取适量上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示： 表达的融合蛋白HIS-STK以主要以包涵体形式存在。对该融合蛋白进行低温诱导，在16°C下 经0.5mmol/L IPTG低温诱导表达，该融合蛋白以可溶蛋白形式存在。后采用MERCK公司的 His-tag蛋白纯化方法对其纯化，SDS-PAGE电泳结果显示获得了纯化的蛋白（见图4)。
[0081 ]实施例4多克隆抗体制备
[0082] 取纯化后的重组蛋白His-EtSTK，BCA测定浓度后，以每只兔子200yg蛋白的剂量与 弗氏完全佐剂按1:1的比例混合装入EP管中，然后利用银汞调合器震荡乳化，吸入lmL的注 射器中，在兔子腹股沟皮下多点注射，进行一免。两周后用相同剂量的蛋白与弗氏不完全佐 剂按1:1的比例混合乳化，相同方式进行二免，以后每隔一周进行一次免疫，待五免7天后， 从兔颈动脉采血，收集血清，分装后于-20°C冻存。
[0083]实施例5 EtSTK蛋白免疫原性分析
[0084] 将纯化的重组蛋白His-EtSTK进行SDS-PAGE后，再转移至PVDF膜上，重组蛋白分别 用柔嫩艾美耳球虫可溶性蛋白免疫兔子制备的抗血清、鼠抗His单克隆抗体和兔子阴性血 清作为一抗做Western-blot。二抗用HRP标记的羊抗兔IgG进行Western-blot分析。结果重 组蛋白有反应条带，分子量与预期大小一致(见图5)，表明该重组蛋白具有一定的免疫原 性。
[0085]实施例6免疫荧光检测EtSTK蛋白在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布和定位 [0086]利用实施例4制备的兔抗His-EtSTK多克隆抗体和FITC绿色荧光标记的羊抗兔二 抗，分别观察EtSTK蛋白在柔嫩艾美耳球虫子孢子以及子孢子体外感染鸡胚成纤维细胞DF-1后不同发育阶段虫体的分布和表达，包括PBS孵育lh的子孢子、完全培养基(DMEM)孵育lh 的子孢子和子孢子接入DF-1细胞后211、4811、6011、6811、7211、8411后分布情况。结果如图6所示， 发现EtSTK主要位于子孢子顶端的表面(A，B);当子孢子加入DMEM中后，该蛋白分泌到子孢 子顶端(C);当子孢子加入DF-1细胞2h后，发现该蛋白主要位于虫体的顶端(D);在入侵DF-1 细胞48-68h后，蛋白主要分布在滋养体和未成熟裂殖体的表面(F，G，H);当虫体发育至成熟 裂殖体时，蛋白主要分布在第一代裂殖子的两端(J，K，L)。
[0087]实施例7体外抑制试验分析EtSTK是否与子孢子入侵宿主细胞有关
[0088] 免疫荧光检测发现EtSTK蛋白主要位于子孢子顶端的表面，且当子孢子加入完全 培养基(DMEM)，该蛋白在子孢子顶端分泌加强，当加入DF-1细胞2h后，该蛋白主要位于顶 端，因此推测该蛋白可能与柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞有关。本实施例利用体外 抑制试验验证正EtSTK蛋白是否是入侵相关蛋白。
[0089] 提取新鲜的子孢子，用CFDA SE细胞增殖和示踪检测剂标记子孢子。利用Protein A+G Agarose纯化兔抗His-EtSTK抗血清的IgG，将纯化的IgG分别以浓度50yg/mL、lOOyg/ mL、200yg/mL、400yg/mL量与子孢子在37°C水浴锅中孵育2h;同时取一健康兔IgG作为阴性 对照，在相同的条件下，用相同浓度的抗体作用子孢子。分别接种DF-1细胞中，培养14h后， 用流式细胞分析仪进行分析。
[0090] 结果显示:兔抗His-EtSTK抗体作用子孢子后，与对照组相比子孢子入侵DF-1细胞 的能力下降，且随着抗体浓度的不断增大，作用后子孢子入侵力逐渐降低，抗体抑制率逐渐 升高，当抗体浓度为400yg/mL，抑制率为70 %左右(见图7 )，说明EtSTK蛋白参与了柔嫩艾美 耳球虫入侵宿主细胞的过程。
[0091] 实施例8 EtSTK基因在真核表达系统中的表达
[0092] 1 ?重组真核质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK的构建
[0093] 将鉴定正确的重组质粒pCold I-EtSTK和真核表达载体pcDNA3.1_flag分别用 BamH I和EcoR I进行双酶切，电泳后将EtSTK目的条带和酶切的pcDNA3.1-flag载体分别进 行胶回收，然后4°C连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞中，经PCR鉴定 为阳性的菌液提质粒进行双酶切鉴定（见图8)，结果显示：成功构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-flag-EtSTK。
[0094] 2.真核重组表达质粒口〇0嫩3.141&84七311(转染鸡胚成纤维细胞(0?-1细胞） [0095]将处于对数生长期的DF-1细胞用胰酶消化后，按每孔60万细胞置于6孔细胞培养 板中传代培养，24h后开始转染，转染步骤按照Lipof ectamine2000操作说明书进行，一组转 染口〇0嫩3.1-^&84丨311(，一组转染？〇0嫩3.141 &8作为对照。细胞在37°(：含5%邙2的细胞 培养箱中培养48h后，取出转染的细胞分别进行间接免疫荧光（IFA)和Western blot检测表 达情况。利用兔抗Hi s-EtSTK蛋白的多抗为一抗，FITC标记(绿色荧光）的山羊抗兔抗体为二 抗，对真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK转染48h后的DF-1细胞进行免疫荧光检测。 结果显示:pcDNA3.1-flag-EtSTK转染的DF-1细胞检测到明显的绿色荧光，而pcDNA3.1-flag转染的DF-1细胞未见绿色荧光，表明真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK成功转 染DF-1细胞，且能在DF-1细胞中表达(见图9)。
[0096]同时收集转染的DF-1细胞，加入Western及IP细胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE电泳 后转移至PVDF膜上，进行Western-Blot检测蛋白是否表达，一抗为兔抗Hi-EtSTK蛋白多抗 血清，二抗为近红外荧光羊抗兔IgG。结果显示，在转染重组质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK的 DF-1细胞中，可以检测到大小为58kDa的蛋白质条带；而在转染空载体质粒的DF-1细胞中， 未检测到相应的目的条带（图10)。表明？〇0财3.141 &84七3!1(重组质粒在0?-1细胞中表 达。
[0097]结果表明EtSTK在真核表达系统中能成功表达，可用于筛选新型疫苗（包括DNA疫 苗、重组蛋白疫苗)和新型药物的靶标。
[0098]实施例9用免疫共沉淀技术验证Et STK基因与Et AMA1的相互作用关系
[0099] 1 ?重组真核质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK的构建
[0100] 过程如实施例8所示。
[0101] 2 ?真核重组表达质粒pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK转染DF-1细胞
[0102]将处于对数生长期的DF-1细胞用胰酶消化后，按每孔60万细胞置于6孔细胞培养 板中传代培养，24h后开始转染，转染步骤按照Lipof ectamine2000操作说明书进行，以 pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK 和 pCAGGS-EtAMAl 共转染 DF-1 细胞，设置对照组:正常 DF-1 细胞、DF-1 转染pcDNA3.1-flag空质粒、DF-1 单转染pcDNA3. l-flag-EtSTK、DF-l单转染pCAGGS-EtAMAl。细胞在37°C含5%C02的细胞培养箱中培养48h后，取出转染的细胞进行CO-IP实验。 [0103] 3.0)-1?验证￡七311(与￡七舰41的相互作用关系
[0104] 取lml Protein A/G珠子，500g离心，PBS洗涤2次后将其溶于500yl PBS中；使用冰 浴过的PBS洗涤转染的DF-1细胞，以lml/板的RIPA裂解液于冰上裂解DF-1细胞，将蛋白裂解 液转入EP管中超声裂解，12000g，4°C离心15min，将上清转入新的EP管中，取40yl上清混合 lOyl 5X loading buffer作为Input，剩余上清中加入80iil Protein A/G珠子，4°C振摇2h (预结合）；预结合完成后500g离心2min，取上清分为两份，一份加入EtSTK多克隆抗体，一份 加入EtAMAl单克隆抗体，4°C摇床过夜，结束后加入Protein A/G珠子40yl，4°C振摇4h后4°C 500g离心2min，弃上清;剩余珠子以不加脱氧胆酸钠的RIPA溶液洗涤4遍后4°C1000r/min离 心2min，弃上清，沉淀加入40iil 2xloading buffer煮沸，Westem-Blot检测两者是否相互作 用。结果显示无论是以EtAMAl为诱饵捕获EtSTK蛋白还是以EtSTK为诱饵捕获EtAMAl蛋白， Western-Blot在相应位置上都能显示出大小符合预期的条带（图11 )，证明Et STK与Et AMA1相互作用。
[0105] 实施例10用GST pull-down技术验证EtSTK基因与EtAMAl的相互作用关系 [0106] GST Pull-down是一种常用的在生物体外研究蛋白质相互作用的实验技术。GST Pul 1-down和免疫共沉淀基本原理相似:细菌表达的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白主要 用于蛋白的亲和纯化，也可将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然 后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在 得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质-蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST 沉降技术。该方法只用于体外确定蛋白质相互作用。与免疫共沉淀技术相比，GST Pulldown 的融合诱饵蛋白在体外系统中表达，可能出现蛋白翻译后修饰不足，由于该实验是体 外研究蛋白质间的相互作用，不能完全反映反映体内蛋白的相互作用。但由于GST Pulldown 外源表达系统简便、蛋白表达周期短，且谷胱甘肽和 GST 融合蛋白亲和性高，易分离出 大量蛋白进行批量实验。目前主要应用于确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间的新 的相互作用；以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。本研究的按照Thermo提 供的操作说明书进行，实验结果用western blot来检测。结果如图12所示，由图可知，用 GST-AMA1蛋白捕获的Input的Western blot图中只有一条条带，所以Et STK基因与Et AMA1 之间有相互作用，与CO-IP结果一致。
[0107]实施例11 Et STK重组蛋白和真核表达质粒的免疫保护性 [0108] l.Et STK重组蛋白的大量制备与纯化
[0109] 按照实例3步骤大量表达pCold I-EtSTK重组蛋白并纯化，经测定蛋白浓度后，按 照100yg/mL的蛋白剂量进行乳化，一免乳化试剂为弗氏完全佐剂，二免乳化试剂为弗氏不 完全佐剂。根据免疫鸡只数量，乳化相应的蛋白剂量。
[0110] 2 ? PCDNA3 ? 1-f lag-EtSTK真核表达质粒的大量制备
[0111] 将实例8构建的真核表达质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK扩大培养，SDS碱裂解法大量 提取免疫所用质粒:pcDNA3 ? 1-f lag空载体、pcDNA3 ? 1-f lag-EtSTK重组质粒，测定0D 260/ 280大于1.8，小于2.0，测定质粒浓度后保存于-20°C，临用前稀释为lyg/yl。
[0112] 3.动物保护性试验
[0113] 100只体重相近的二黄鸡，随机分成5组，每组20只，7日龄进行首免，5个组分别为 重组蛋白pCold I-Et STK免疫组(肌注，100yg/只）、pcDNA3.1-flag-EtSTK真核表达质粒组 (肌注，l〇〇yg/只）、pcDNA3 ? 1-f lag空载体组(肌注，100yg/只）、非免疫感染组(肌注，TE稀释 液，100此/只）以及非免疫非感染组(肌注，TE稀释液，100此/只）。14日龄进行二免，免疫剂 量和途径与一免时相同。21日龄，除非免疫非感染组之外，其余各组以IX 104/羽柔嫩艾美 耳球虫上海株孢子化卵囊的剂量进行攻虫。28日龄时结束实验，通过鸡的增重、盲肠病变记 分、卵囊产量等指标进行免疫效果评价。
[0114] 试验结果如下：
[0115] 1、增重效果
[0116] 表4各组鸡增重情况
[0118] 由表4可知，在免疫期间，各免疫组的增重与小免疫组的相当（P>0.05)，说明免疫 对肉鸡生长无不良影响。在攻虫期间，Et STK重组蛋白组和真核质粒免疫组的增重与非免 疫非攻虫组的相当（P>〇.〇5)，均明显高于非免疫攻虫组和空质粒pcDNA3.1-flag组(P< 0.05)，说明肌注Et STK重组蛋白组或真核表达质粒对球虫感染具有一定的抵抗作用，而空 质粒无此作用。
[0119] 2、0PG值(克粪便卵囊数）
[0120] 攻虫后第5-7天，每天收集各组粪便，称重，用麦氏虫卵计数法计算每克粪便的卵 囊数(0PG)，统计平均每只鸡的排卵囊总量。具体操作如下:将取回的粪便混匀后，每组各取 2g，加入58mL蒸馏水混勾后，经2层纱布过滤后，取2mL滤液加入4mL饱和盐水，充分混勾后， 取卵囊液注满麦氏计数板，静置l〇min，镜检麦氏计数板两个计数室的卵囊数，取平均数计 为A。计数室容积为0.15mL，故OPG值为A X 600。平均每只鸡每天的排卵囊量=(OPG X粪便总 重量每组鸡的数量;将攻虫后第5-7天每只鸡每天的排卵囊量累计起来，即得到每只鸡 的排卵囊总量。
[0121 ]卵囊减少率(保护率）= [(感染非免疫组每只鸡的排卵囊总量-试验组每只鸡的排 卵囊总量)/感染非免疫组每只鸡的排卵囊总量]X 100%。结果如表5所示。
[0122] 表5各组平均每只鸡排卵囊总量(107)
[0124] 由表5可知，各免疫组对鸡球虫的繁殖均有一定程度的抑制作用，均明显少于非免 疫攻虫组(P<〇.05)，而Et STK重组蛋白组和真核质粒免疫组的卵囊减少率明显高于空质 粒组(P<0.05)，说明肌注重组蛋白组或真核表达质粒能显著性地抑制球虫卵囊的繁殖，效 果明显好于空质粒。
[0125] 3、盲肠病变记分
[0126] 攻虫后第7天剖杀鸡只，取盲肠，参照Johnson and Reid(1970)的标准进行病变记 分，具体标准如下：
[0127] 0分，无肉眼病变
[0128] +1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。
[0129] +2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。
[0130] +3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物）， 肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。
[0131] +4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记 +4分。结果如6所示。
[0132]表6各组盲肠病变记分
[0134] 由表6可知，Et STK重组蛋白组和真核质粒免疫组的病变记分均明显低于非免疫 攻虫组和空质粒组(P<〇.05)，说明肌注重组蛋白组或真核表达质粒对鸡球虫造成的盲肠 病变有一定的改善作用。
[0135] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为Et STK基因，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。2. -种编码柔嫩艾美耳球虫基因的多核苷酸，其特征在于，所述基因为Et STK基因，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种含有编码柔嫩艾美耳球虫基因的多核苷酸的DNA分子，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。4. 一种重组载体，其特征在于，包含编码EtSTK蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，所述Et STK蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。5. -种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求3所述重组载体经表达而制 得。6. -种多克隆抗体，其特征在于，该多克隆抗体是用权利要求4所述重组蛋白免疫新西 兰大白兔而制得。7. 权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球 虫病的疫苗或药物。8. 权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于筛选预防或治疗鸡球 虫病的药物。9. 权利要求4所述重组蛋白的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗 或药物。10. -种疫苗，其特征在于，包含权利要求4所述重组蛋白，或权利要求5所述重组载体， 该重组载体为真核表达载体。11. 一种作用靶标为Et STK蛋白的抗球虫药物。
【文档编号】A61P33/02GK105821056SQ201610069719
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年2月1日
【发明人】董辉, 黄兵, 朱雪龙, 韩红玉, 赵其平, 朱顺海, 李聪, 王自文, 门启斐, 夏伟丽, 杨致远
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所