水稻黄绿叶性状基因ygl8及其在水稻育种中的用图
【专利摘要】本发明公开了一种水稻黄绿叶性状基因<i>ygl8</i>及其在水稻育种中的用途，属于遗传育种领域。该水稻黄绿叶性状基因<i>ygl8</i>的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，其所对应的野生型基因<i>YGL8</i>的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示；野生型基因<i>YGL8</i>所编码蛋白质为叶绿素合成途径中的一个关键酶——镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶，其氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。本发明中提供的<i>ygl8</i>基因，在水稻育种的杂交F1代杂种纯度鉴定和不育系自交繁殖保种纯度鉴定工作中具有广阔的应用前景。
【专利说明】
水稻黄绿叶性状基因 ygl8及其在水稻育种中的用途
技术领域
[0001]本发明属于遗传育种领域，具体涉及水稻黄绿叶性状基因 ygl8(yellow green leaf 8)及其在水稻育种中的用途。
【背景技术】
[0002] 水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一。杂交水稻的出现，大幅度 地提高了水稻的产量，为缓解中国乃至世界的粮食危机做出了巨大贡献。然而，在两系杂交 水稻的制种过程中，不育系的育性会受到光温的影响(廖伏明，袁隆平，2003)。当气候异常 时，不育系会因自交结实而影响杂种F1的纯度，可能给农业生产带来严重的损失。缺乏理想 的鉴定杂种种子纯度的技术方法一直是制约我国种子产业发展的原因之一。在解决杂交水 稻育种的这一突出问题时，叶色突变体的应用价值得到了体现。将苗期叶色标记与不育系 相结合，根据杂交F1代植株的叶色表型，可以很方便地肉眼识别出不育系自交种子，从而鉴 定杂种纯度(Su et al.，2012)。同理，带叶色标记的不育系自我繁殖过程中，也可方便地剔 除杂种。早些年，科学家们已选育出了一些具有黄化(或白化)叶色标记的不育系，像M2S(董 凤高等，1995)、中紫S(曹立勇等，1999)、全龙A(舒庆尧等，2001)、白丰A(沈圣泉等，2005) 等，并用它们培育出了很多杂交品种。
[0003] 广占63S是N422S和矮广占63杂交后再自交选育而来的光温敏感型核不育系，在杂 交育种应用研究中具有重要的作用。很多水稻杂交品种来源于广占63S，像丰两优1号(广占 63SX9311)，广占63S*R2469(广占63SXR2469)，广两优 1128(广占63SXHR1128)，广两优 7203(广占63SX中恢7203)，两优18(广占63SX丰恢18)等等。作为源于广占63S的自发黄绿 叶突变体，本发明的y g18基因在杂交育种的不育系纯度和?:杂种纯度鉴定工作中具有广阔 的应用前景。
[0004] 参考文献：
[0005] 曹立勇，钱前，朱旭东，曾大力，阂绍楷，熊振民.紫叶标记籼型光-温敏核不育系中 紫S的选育及其配组的杂种优势.作物学报，1999，25( 1): 44-49.
[0006] 董凤高，朱旭东，熊振民，程式华，孙宗修，阅绍措.以淡绿叶为标记的籼型光-温敏 核不育系M2S的选育.中国水稻科学，1995，9(2):65-70.
[0007]廖伏明，袁隆平.光温敏不育水稻不育性表达不稳定的遗传机制与原因综述.杂交 水稻，2003,18(2): 1-6.
[0008] 舒庆尧，陈善福，吴殿星，沈圣泉，崔海瑞，夏英武.新型不育系全龙A的选育与研 究.中国农业科学，2001，34(4): 349-354.
[0009] 沈圣泉，舒庆尧，吴殿星，陈善福，夏英武.白化转绿型水稻三系不育系白丰A的选 育?杂交水稻，2005，20(5): 10-11 ?
[0010] Su N,Hu ML,ffu DX,ffu FQ,Fei GL,Lan Y,Chen XL,Shu XL,Zhang X,Guo XP, Cheng ZJ,Lei CL，Qi CK,Jiang L,ffang H,ffan JM.2012.Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production.Plant Physiol 159,227-238.
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种水稻黄绿叶性状基因ygl8。本发明的目的还在于提供 ygl8基因在水稻育种中的应用。
[0012] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0013] 一种水稻黄绿叶性状基因ygl8,其核苷酸序列如Seq ID NO. 1所示。
[0014] 所述的水稻黄绿叶性状基因ygl8对应的野生型YGL8基因的核苷酸如Seq ID NO.2 所示。YGL8基因编码的蛋白质的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。YGL8基因所在的基因组核 苷酸序列如Seq ID N0.4所示，Seq ID N0.4所示序列包含启动子序列、基因区序列和终止 子序列，共5146bp。
[0015]本发明的水稻黄绿叶性状基因ygl8是从一个来源于光温敏感型核不育系广占63S 的黄绿叶突变体yg18中发现的。从苗期开始，突变体ygl8的叶片呈现黄绿叶表型。在海南陵 水种植时，突变体ygl8生长发育状态与野生型相近，但在湖北武汉种植时，突变体ygl8发育 严重迟缓。本发明采用图位克隆的方法克隆了黄绿叶突变体ygl8的性状控制基因ygl8。 ygl8基因是由L0C_0s06g04150基因的点突变而来的，即Seq ID勵.2的第673位核苷酸(：，突 变成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T。生物信息学分析显示YGL8编码叶绿素合成途径中 的一个关键酶--镁原卟啉K甲基转移酶。
[0016] 本发明的水稻黄绿叶性状基因ygl8可用于水稻育种中。ygl8基因在基因组中处于 杂合状态时植株呈正常绿叶表型，而在基因组中处于纯合状态时植株呈黄绿叶表型。因此， 在杂交育种过程中，以含纯合ygl8基因的材料为母本，其它材料为父本，杂交Fi代种子的植 株为绿叶表型，其中混杂的少量的自交种的植株为黄绿叶表型，使得杂交Fi代杂种纯度鉴 定工作直观而方便；用含有纯合ygl8基因的不育系自交繁殖保种时，其后代种子的植株为 黄绿叶表型，而花粉污染产生的种子，其植株为绿叶表型，使不育系的保种纯度鉴定工作也 变得简单方便。因此，ygl8基因可用于杂交育种过程中杂交Fi代杂种纯度鉴定和不育系自 交繁殖保种纯度鉴定。
[0017] 本发明的水稻黄绿叶性状基因ygl8,为杂交育种提供了新的材料，其在杂交育种 中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为野生型WT和突变体ygl8植株的苗期表型图。
[0019] 图2为WT和突变体ygl8在湖北武汉和海南陵水种植时的生长发育表型图。(A)孕穗 期，（B)成熟期。
[0020]图3为ygl8基因的定位结果图。（A)初步定位，利用ygl8/日本晴的F2群体的92株突 变株，将YGL8定位在第6号染色体的分子标记chr6mm0129和chr6mm0287之间；（B)精细定位， 利用ygl8/93lU^F 2群体的910株突变株，将YGL8定位在分子标记Y37和Y11之间；综合初步 定位和精细定位，将YGL8基因限定在chr6mm0129和Y11之间343kb的区域。（C)定位区间内经 测序唯一的有突变的基因，命名为YGL8，C到T的点突变导致所编码的氨基酸由亮氨酸变为 苯丙氨酸。
[0021] 图4为功能互补载体的构建示意图。互补载体PYGL8C为在转基因双元载体pBWA(V) HII上构建入一个5146bp的包含YGL8基因的启动子(Pro,2732bp)、基因（YGL8,981bp)和终 止子(Ter，143 3bp)的基因组片段;pEmvC为pBWA (V) HII空载体，作为对照。
[0022] 图5为对转基因植株的PCR鉴定结果及测序结果图。（A)转基因植株的PCR鉴定结 果，转入空载体pEmvC和互补载体pYGL8C的植株均能扩增出潮霉素筛选基因HYG，表明转基 因植株构建成功。(B)空载体pEmvC和互补载体pYGL8C的转基因植株在ygl8基因突变位点的 喊基测序。
[0023] 图6为野生型WT、突变体ygl8和转基因植株的表型、叶绿素含量测定结果图。(A)植 株表型，转入互补载体PYGL8C的植株表型得到恢复。（B)叶绿素含量测定，数据为平均值土 标准差，n = 3。
【具体实施方式】
[0024] 为了更充分的解释本发明的实施，下面提供了水稻黄绿叶基因 ygl8的实施实例。 这些实施实例仅仅是说明性的、而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。 [0025]实施例1水稻黄绿叶基因 ygl8的定位克隆和YGL8基因的功能互补
[0026] 1、水稻材料：
[0027] 水稻黄绿叶突变体yg 18,保存于湖北省农作物种质资源中期库（保存号 HB2016001，湖北省农业科学院粮食作物研究所）；其野生型品种为籼稻品种"广占63S"。 [0028]水稻黄绿叶突变体ygl8是广占63S的自发突变产生的，突变表型为黄绿叶（图1)。 另外，ygl8在湖北武汉生长发育严重迟缓甚至停滞，但在海南陵水的生长发育与野生型相 近(图2)。经多代繁殖，ygl8突变表型稳定遗传。
[0029] 2、群体构建和遗传分析
[0030] 利用突变体ygl8,分别与日本晴、02428、9311，进行杂交，4个组合?1表型均为正常 绿叶表型，Fi自交，得到F2群体。在4个^群体中，正常绿叶与黄绿叶植株数目均符合3:1的分 离比，表明突变性状受细胞核隐性单基因控制。结果如下表所示：
[0031]表l.ygl8的遗传分析
[0033] 表注:杂交组合:母本/父本；肉眼观察野生型和突变体绿叶、黄绿叶表型;x2〈x20. 05 =3.84表示符合3:1的性状分离比;P>0.05表示可信。
[0034] 3、用图位克隆的方法定位ygl8基因
[0035]杂交内植株种于温室约30d，单株取样用来提取基因组DNA。基因组DNA的提取采用 CTAB法，获得的DNA沉淀溶解于100yL超纯水中。图位克隆的每个PCR反应用0.5yL DNA样品。 PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭(EB)染色来进行检测。
[0036] CTAB法提取基因组DNA的步骤如下：
[0037] (1)用液氮将约0.5g的所取叶片粉碎成细粉，置于2mL的EP管中。
[0038] (2)加600此的(7^8溶液（2%(111/^)(7^8，100111111〇1/11>18-(：1，20111111〇1/1￡0丁八， 1.4mol/L NaCl;pH 8.0)，置于65°C的水浴锅内lh。
[0039] (3)用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提，颠倒使充分混勾，于10000r/min离心5min， 回收上(水)相。
[0040] (4)取上清，加入十分之一体积的3M乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇（或2倍体积无水 乙醇)沉淀DNA，充分混勾，于_20°C放置30min以上。4°C，10000r/min离心10min。
[00411 (5)用75 %乙醇洗涤沉淀物2次，干燥，用100yL超纯水重悬溶解。
[0042] 图位克隆的PCR反应体系（25yL)为：ddH20 16yL，10 X Tag缓冲液(含(順4) 2S〇4) 2 ? 5 yL，MgCl2 2.5yL，dNTPs(各2.5mM)lyL，引物P1/引物P2 l/lyL，DNA模板0.5yL，Tag DNA聚合 酶（Thermo 5(^6帥1行(：）0.5此。？0?反应程序为：951€5111111;95 1€3〇8,521€3〇8,721€3〇8,35 个循环;72°C10min。
[0043] ygl8基因的初步定位:根据已公布的粳稻和籼稻之间可能存在差异的SSR和InDel 分子标记，用ygl8和日本晴的基因组DNA，筛选出了近似均匀分布于12条染色体的多态性分 子标记。在ygl8/日本晴的^定位群体中选取92个隐性个体，提取DNA，利用筛选出的多态性 分子标记进行PCR扩增，检测分子标记在每个隐性个体中的带型分布，将ygl8基因初步定位 在第6号染色体上chr6mm0129和chr6mm0287两个SSR标记之间（如图3A所示）。引物序列见表 2〇
[0044] ygl8基因的精细定位:在chr6mm0129和chr6mm0287之间以及附件的区域，开发出 ygl8和9311之间的多态性分子标记。在ygl8/9311的F2定位群体中选取910个隐性个体，提 取DNA，将ygl8基因定位在分子标记Y37和Yl 1之间的区域内（如图3B所示）；综合初步定位和 精细定位结果，最终将ygl8基因锁定在chr6mm0129和Y11这两个分子标记之间（如图3B所 示）。引物序列见表2。
[0045]表2.定位引物及序列
[0047] 4、候选基因的确定
[0048] 根据得到的343kb的精细定位区间，在水稻基因组注释项目（Rice Genome Annotation Pro ject，http: //rice ? plantbiology .msu ? edu/)上进行预测，发现共有41 个 基因。利用PCR的方法，将突变体ygl8中这41个基因所在的基因组序列扩增出来，测序分析， 发现只有一个基因（L0C_0s06g04150)出现突变，该基因C到T的单碱基突变（即Seq ID N0.2 的第673位核苷酸C，突变成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T)，导致蛋白质产物上该位点 的氨基酸编码从亮氨酸变为苯丙氨酸（如图3C所示）。因此将候选基因L0C_0s06g04150进行 功能互补验证。
[0049] 上述PCR反应体系（50yL)为：ddH20 17.5yL，2XPrimeSTAR GC缓冲液25yL，dNTPs (各2.5mM)4yL，引物P1/引物P2 1/lyL，基因组DNA lyL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa) 0.5此。卩〇?反应程序为：951€5111111;95°(：1111111，60 1€308,721€4111111，30个循环；72°(：10111111。
[0050] 5、功能互补载体的构建与转基因功能互补
[0051 ] 以野生型广占63S的基因组DNA为模板，用2对引物通过PCR扩增出L0C_0s06g04150 (YGL8)基因的上游启动子（2732bp)、基因（981bp)和下游终止子（1433bp)所在的基因组序 列。2对引物分别为：
[0056] 上述2对引物中的有下划线的加粗斜体部分为用于酶切和连接的Aarl内切酶接头 序列，其中大写部分为Aar I内切酶识别位点；非下划线部分为对应的基因组DNA特异引物序 列。
[0057] 用凝胶回收试剂盒(BioSpin Gel Extraction Kit，BioFlux)分别回收2种目的 PCR片段，再用AaH酶切后用凝胶回收试剂盒回收待用;转基因双元载体pBWA(V)HII(购于 武汉伯远生物科技有限公司;http: //www. biorun. net/)用Bsal酶切后，用凝胶回收试剂盒 回收待用;将酶切回收后的目的片段和载体进行连接反应，成为重组载体。
[0058] 上述PCR体系和反应程序与本实施例第4步(候选基因的确定）中的相同。
[0059] 上述目的片段酶切体系（100此总体积）为：ddH20 39yL，10X酶切Buffer 10此， YGL8C1 片段/YGL8C2片段50yL，AarI(Thermo Scientific)lyL〇
[0060]上述载体酶切体系（50yL总体积）为：ddH20 34yL，10X酶切Buffer 5yL，pBWA(V) HII 质粒lOyL，Bsal (Thermo Scientific) lyL〇 [0061 ] 酶切反应在37°C下进行2-4h。
[0062] 上述连接反应体系（10yL总体积）为:ddH20 1.5yL，10 X T4DNA连接酶缓冲液1此， pBWA(V)HII质粒酶切回收片段lyL，YGL8Cl酶切回收片段3yL，YGL8C2酶切回收片段3此， T4DNA连接酶(Thermo Scientific)0.5yL。连接反应步骤为：22°C过夜。产物转化进入大肠 杆菌DH10B。
[0063] 重组载体中5146bp的基因组片段经测序与野生型广占63S的基因组对应序列完全 一致(如Seq ID N0.4所示），则该互补用载体在实验中命名为pYGL8C;空载体在实验中重新 命名为pEmvC(载体示意图如图4所示）。将pYGL8C和pEmvC分别转化进入农杆菌，浸染突变体 ygl8的愈伤组织，进行转基因互补实验。转基因过程由武汉伯远生物科技有限公司 (ht tp: //www ? b i orun .net/)代理进行。
[0064]对转基因再生植株进行阳性鉴定，提取转基因植株的基因组DNA，用引物HYG-F: TCTACACAGCCATCGGTCCAG 和 HYG-R: GAAAAGITCGACAGCGTCTCC 来 PCR 扩增潮霉素筛选基因 HYG， 结果如图5A所示，转化了pYGL8C和pEmvC的植株都为转基因阳性;同时用yg 18突变位点两端 转基因植株中的突变位点附近序列进行PCR测序分析，结果如图5B所示，转pYGL8C的表型恢 复植株中该位点同时存在C和T，而转空载体pEmvC的植株中该位点仅是与突变体ygl8-样 的T。转候选基因互补载体pYGLSC的植株恢复了正常表型、且叶绿素含量恢复正常，而转空 载体pEmvC的植株还是黄化表型、且叶绿素含量与ygl8突变体相近(如图6A和6B)。基因L0C_ 0s06g04150所在的基因组序列成功挽救了ygl8突变体的表型，说明ygl8基因就是L0C_ 0s06g04150突变而来的。
[0065] 上述检测和测序用的PCR体系和反应程序与本实施例第3步（用图位克隆的方法定 位ygl8基因）中的图位克隆用的PCR体系和反应程序相同。
[0066] 上述叶绿素含量测定的步骤如下：
[0067] 将叶片剪碎用液氮研磨，取0. lg样品，加入5mL 80 %丙酮，4°C遮光抽提2.5h;再于 4°C下，14000rpm离心10min，取上清用80 %丙酮稀释5倍后，吸取200此测定663nm和647nm处 的吸光度，并计算叶绿素含量。计算公式如下：
[0068] Ca(叶绿素 a) = 12 ? 25A663-2 ? 79A647，
[0069] Cb (叶绿素b) = 21 ? 50A647-5 ? 10A663，
[0070] Ca+b = 7.15A663+18.71A647,
[0071 ]单位:lig/mL。
[0072] 故叶片中的叶绿素含量为：（5*5扣&+13)/0.1，单位邱/^?1^1 :鲜重。
[0073] 6、YGL8的生物信息学分析
[0074]野生型中功能的YGL8没有内含子，编码326个氨基酸的蛋白质（序列见Seq ID No. 3)。突变体中由于G到T的点突变，导致编码的第225个氨基酸由亮氨酸(Leu)变为苯丙氨 酸(Phe)。根据NCBI(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)的基因注释信息，YGL8编码叶绿素合 成途径中的一个关键酶一一镁原卟啉K甲基转移酶。
[0075]实施例2在水稻材料中鉴定ygl8基因
[0076]根据本发明实施例1中的结果，ygl8基因是L0C_0s06g04150基因的点突变而来的， 即Seq ID N0.2的第673位核苷酸C，突变成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T。因此，本实施 例采用PCR-测序的方法，鉴定水稻材料中是否含有ygl8基因，水稻材料基因组中如果含有 Seq ID NO. 1所示的序列，则其含有yg 18基因。采用CTAB法提取水稻材料DNA(同实施例1中 的方法），用ygl8突变位点两端的引物（YGL8MutationF:CGCGCCTACTTCAACTCCA和 YGL8MutationR:GATCATCTGCTTCGCCTCCT)进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序结果与 ygl8的编码区序列（Seq ID NO. 1)进行比对，分析测得序列对应于序列（Seq ID NO. 1)的第 673位核苷酸是C还是T，是T则含有ygl8基因。
[0077] 在本实施例中，鉴定了不同水稻品种（结果见表3)，如广占63S、9311、02428、日本 晴、ZH11、空育131、粵泰B、川香29B和松粳13,它们的基因组上对应于ygl8突变碱基处的核 苷酸均为C，表明它们的基因组中均为野生型的YGL8基因，不含有突变型ygl8基因。检测的 杂交组合ygl8/日本晴、ygl8/9311，它们的FHf植株基因组上对应于ygl8突变碱基处的核 苷酸均为C和T同时存在，即含有杂合的ygl8基因。进一步检测了杂交组合ygl8/9311的F 2R 植株基因组上对应于ygl8突变碱基处的核苷酸，F2代黄绿叶植株的基因组在该处碱基均为 T，含有纯合的ygl8基因；而？ 2代绿叶植株的基因组在该处碱基为C(纯合的野生型YGL8基 因）、或者C和T同时存在(含有杂合状态的ygl8基因）。
[0078]表3. ys?18基因的突变碱基在不同的水稻材料中的对应碱基
[0080] 表注:杂交组合:母本/父本。F2植株随机取自ygl8/9311的F2群体。？!植株各取10株 进行检测，F2植株取10株绿叶植株(Gl-G10)、10株黄绿叶植株(Y1-Y10)进行检测。
[0081 ]实施例3含有ygl8基因的黄绿叶突变体ygl8应用于水稻育种过程中
[0082]黄绿叶突变体ygl8为光温敏不育系广占63S自发突变而来，本身即为不育系，可直 接用于水稻育种工作中。
[0083] 首先，ygl8基因可用于杂交水稻育种F#杂种纯度鉴定。以突变体ygl8为母本，以 其它水稻材料为父本，进行杂交，Fi代杂种植株为正常绿叶表型，而混杂在Fi代杂种中的母 本自交产生的种子、其长成的植株为黄绿叶表型，肉眼即可辨别。本实施例中，杂交组合 yg18(母本)/9311(父本)的？:代种子，发苗126颗，其中123颗苗呈正常绿叶表型、3颗苗呈黄 绿叶表型，因此该组合此次的Fi代杂种纯度为97.6%。
[0084] 其次，ygl8基因可用于不育系自身保种的种子纯度鉴定。突变体ygl8自交繁殖的 种子，其植株为黄绿叶表型;而自交繁殖过程中因其它水稻材料花粉污染所产生的杂种，其 植株为正常绿叶表型。本实施例中，对一批次突变体ygl8自交繁殖的种子发苗621颗，其中 495颗呈黄绿叶表型（为纯种），126颗为正常绿叶表型（为混杂种），因此该批次自交保种材 料的种子纯度为79.7%，花粉污染较为严重;而对另一批次突变体ygl8自交繁殖的种子发 苗503颗，这503颗植株均为黄绿叶表型，因此该批次自交保种材料的种子纯度为100%。
[0085] 推而广之，本领域技术人员应当理解，利用ygl8突变体通过杂交的手段将ygl8基 因导入其它水稻材料所产生的新材料，也将具有ygl8突变体的黄绿叶性状，具有与本实施 例3相同的应用前景。此类新材料的鉴定方法与实施例2中的相同。
[0086] 虽然以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的 实施例。本领域技术人员应当理解，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何 形式和细节的修改和变化，均属于本发明所要保护的范围。另外，本发明说明书和权利要求 书中所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。
【主权项】
1. 一种水稻黄绿叶性状基因 ygis，其特征在于:该水稻黄绿叶性状基因 ygl8的核苷酸 序列如Seq ID NO. 1所示，其所对应的野生型基因 YGL8的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。2. 权利要求1所述的水稻黄绿叶性状基因 ygl8在水稻育种中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:包括杂交^代杂种纯度鉴定、不育系自交繁 殖保种纯度鉴定。
【文档编号】C12Q1/68GK105821058SQ201610392493
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】王兆海, 李阳生, 洪潇, 胡柯柯
【申请人】武汉大学