一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，包括以下步骤：（1）缢蛏预处理；（2）酶解；（3）超滤分离；（4）快速蛋白纯化系统分离纯化；（5）高效液相色谱系统分离纯化。本发明以缢蛏为原料，通过中性蛋白酶酶解缢蛏，并利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化后得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽（ACE 抑制肽），提取分离工艺合理，可操作性强，为从缢蛏中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
【专利说明】
一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法。
【背景技术】
[0002]高血压是困扰当今的一种心血管疾病，可导致严重的并发症，对人类健康危害极大。血管紧张素转化酶(Ang1tensin-converting enzyme，ACE)在机体血压调节过程中起重要作用，一方面ACE将无活性的血管紧张素I转化为具有强烈收缩全身微动脉，使血压升高的血管紧张素Π;另一方面ACE能促进有降血压作用的缓激肽分解，引起血压升高。
[0003]现今人工合成的卡托普利、依那普利和赖诺普利等ACE抑制剂，这些药物具有很强的降血压作用，但长期服用会产生眩晕、恶心、剧烈咳嗽、味觉异常、肾功能损害等副作用。许多研究表明源于食物中的短肽具有降血压的功效，Da1-Hung Ngo等以太平洋鳕鱼皮为原料，用木瓜蛋白酶进行酶解，经分离纯化后得到降血压肽:Thr-Cys-Ser-Pro ； Hasan F等利用胃蛋白酶酶解鲣鱼肉，经分离纯化后得到高活性降血压肽(IKYGD);源于食物中的生物活性肽具有安全、无毒副作用，且易于机体吸收等特点。因此，从食物源中制备分离出高活性的ACE抑制肽仍是研究的热点。
[0004]缢蛏(Sinonovacula )是我国沿海常见的贝类，属于优质蛋白源。缢蛏提取物具有抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫作用等功效。但目前尚未见与缢蛏降血压肽相关的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明的发明目的是为了提供一种提取分离工艺合理，可操作性强，产品稳定性好、纯度高的缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，包括以下步骤:
(I)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后，用异丙醇浸泡缢蛏肉3?5h，过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味，脱水得缢蛏肉渣，备用。对缢蛏预处理主要是脱杂蛋白和除去脂质。
[0007](2)酶解:将步骤(I)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:3-4,加酶量1500~20001]/^，？!1值6.5-7.5,酶解温度50?60°C，酶解时间9?12 h，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷后离心，得上清液。
[0008](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤，得到超滤液。
[0009](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到二个活性组分，分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A。
[0010](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到三个活性组分，分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽。
[0011]作为优选，步骤(I)中，缢蛏与异丙醇的质量比为1:3?5。
[0012]作为优选，步骤(2)中，酶解期间不断搅拌。
[0013]作为优选，步骤(2)中，预冷至4?6°C。
[0014]作为优选，步骤(2)中，离心工艺条件为:转速5000?10000rpm/min，离心时间10?30mino
[0015]作为优选，步骤(4)中，快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，将凝胶装柱，Tris-Hcl平衡后(pH为7.4 )，将超滤液配制成20Omg/mI的溶液，每次上样量为3mL，分别用Tr i s-He I (pH为7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为2.2ml/min ；检测波长280nm ；收集各峰。
[0016]作为优选，步骤(5)中，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:2.6 X 80cm；柱料:Sephadex G-25)，将组分B配制成200mg/ml的溶液，上样量:2.0mL;流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm；自动收集速度:
4.0min/管;收集各峰。
[0017]作为优选，步骤(5)中，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAXSB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μ??，4.6 X 150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脱方式:80%A，20%B ；流速:1.0 mL/min ；柱温:25°C ；自动进样，进样量:20μL;检测波长:280 nm0
[0018]因此，本发明具有如下有益效果:以缢蛏为原料，通过中性蛋白酶酶解缢蛏，并利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化后得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽)，提取分离工艺合理，可操作性强，为从缢蛏中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
【具体实施方式】
[0019]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
[0020]实施例1
(I)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后，用异丙醇浸泡缢蛏肉5h，缢蛏与异丙醇的质量比为1:5，过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味，脱水得缢蛏肉渣，备用。
[0021](2)酶解:将步骤(I)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:4，加酶量2000U/g，pH值7.5，酶解温度60°C，酶解时间12 h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至6°C后以转速10000rpm/min离心30min，得上清液。
[0022](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤，得到超滤液。
[0023](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统(Apurifier UPC-1OO型快速蛋白纯化仪，GE生命科学公司)进行分离纯化，得到二个活性组分，分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，将凝胶装柱，Tris-Hcl平衡后(pH为7.4 )，将超滤液配制成20 Omg/m I的溶液，每次上样量为3mL，分别用Tr i s -He I (pH为7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为2.2ml/min ；检测波长280nm ；收集各峰。
[0024](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到三个活性组分，分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，将组分B配制成200mg/ml的溶液，上样量:2.0mL;流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm；自动收集速度:4.0min/管;收集各峰;组分B纯度检测方法为:采用ZORBAXSB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι，4.6 X 150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脱方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱温:25°C ；自动进样，进样量:20yL;检测波长:280 nm。
[0025]实施例2
(I)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后，用异丙醇浸泡缢蛏肉3h，缢蛏与异丙醇的质量比为1:3，过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味，脱水得缢蛏肉渣，备用。
[0026](2)酶解:将步骤(I)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:3，加酶量1500U/g，pH值6.5，酶解温度50°C，酶解时间9h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至4°C后以转速5000rpm/min离心lOmin，得上清液。
[0027](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤，得到超滤液。
[0028](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到二个活性组分，分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，将凝胶装柱，Tris-HcI平衡后(pH为7.4)，将超滤液配制成200mg/ml的溶液，每次上样量为3mL，分别用Tris-Hcl(pH为7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为2.2ml/min;检测波长280nm;收集各峰。
[0029](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到三个活性组分，分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，将组分B配制成200mg/ml的溶液，上样量:2.0mL;流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm；自动收集速度:4.0min/管;收集各峰;组分B纯度检测方法为:采用ZORBAXSB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι，4.6 X 150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脱方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱温:25°C ；自动进样，进样量:20yL;检测波长:280 nm。
[0030]实施例3
(I)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后，用异丙醇浸泡缢蛏肉4h，缢蛏与异丙醇的质量比为1:4，过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味，脱水得缢蛏肉渣，备用。
[0031](2)酶解:将步骤(I)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:3.5，加酶量1800U/g，pH值7，酶解温度55°C，酶解时间10 h，酶解期间不断搅拌，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷至5°C后以转速8000rpm/min离心20min，得上清液。
[0032](3)超滤分离:将上清液经0.45μπι滤膜抽滤后，用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤，得到超滤液。
[0033](4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到二个活性组分，分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A，快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μπι, 10 X 300 mm)，将凝胶装柱，Tri s-Hc I平衡后(pH为7.4)，将超滤液配制成200mg/ml的溶液，每次上样量为3mL，分别用Tris-Hcl(pH为7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为2.2ml/min;检测波长280nm;收集各峰。
[0034](5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到三个活性组分，分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，将组分B配制成200mg/ml的溶液，上样量:2.0mL;流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm；自动收集速度:4.0min/管;收集各峰;组分B纯度检测方法为:采用ZORBAXSB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μπι，4.6 X 150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脱方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱温:25°C ；自动进样，进样量:20yL;检测波长:280 nm。
[0035]本发明提取分离工艺合理，可操作性强，以缢蛏为原料，通过中性蛋白酶酶解后利用超滤技术、快速蛋白纯化系统和高效液相色谱系统对酶解液进行分离纯化得到一种新的血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽，纯度达99%以上)，其经氨基酸测序仪进行N端降解测序，得到五肽，其氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)，其相对分子质量为636.78 Da，TPMGP的IC5Q为0.15 mg/ml，具有较高的ACE抑制活性(ACE抑制率为96.1%以上)，为从缢蛏中制备高活性的ACE抑制肽提供了实验依据。
[0036]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1.一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后，用清水把蛤肉洗净，经高速组织搅碎机匀浆后，用异丙醇浸泡缢蛏肉3?5h，过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味，脱水得缢蛏肉渣，备用； (2)酶解:将步骤(1)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为:料液比1:3?4，加酶量1500~2000U/g，pH值6.5-7.5,酶解温度50?60°C，酶解时间9?12 h，酶解完成后用沸水浴灭活，预冷后离心，得上清液； (3)超滤分离:将上清液经0.45μm滤膜抽滤后，用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤，得到超滤液； (4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化，得到二个活性组分，分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A; (5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化，得到三个活性组分，分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性，取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B，组分B经纯度检测后，即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽。2.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(I)中，缢蛏与异丙醇的质量比为1:3?5。3.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解期间不断搅拌。4.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，预冷至4?6°C。5.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离心工艺条件为:转速5000~10000rpm/min，离心时间10~30min。6.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(4)中，快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μm，1 × 300 mm)，将凝胶装柱，Tris_Hc I平衡后(pH为7.4 )，将超滤液配制成200mg/ml的溶液，每次上样量为3ml，分别用Tris-Hcl(pH为7.4)、0.1mol/L、0.3mol/L、.0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为2.2ml/min;检测波长.280nm;收集各峰。7.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(5)中，高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:.2.6 × 80cm ；柱料:Sephadex G-25)，将组分B配制成200mg/ml的溶液，上样量:2.0mL ；流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm;自动收集速度:4.0min/管;收集各峰。8.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法，其特征在于，步骤(5)中，组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18分析型色谱柱(填料粒径:5μm，4.6 ×.150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA)，流动相B为乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脱方式:80%A，20%B ；流速:1.0 mL/min ；柱温:25°C ；自动进样，进样量:20yL ；检测波长:280 nm。
【文档编号】C12P21/06GK105821102SQ201511011196
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】余方苗, 罗李玉, 杨最素, 黄芳芳, 丁国芳
【申请人】浙江海洋学院