一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用

文档序号:10467166阅读:534来源:国知局
一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用
【专利摘要】本发明公开一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;加水,混匀后升温至50~60℃,调节pH至7.0,加入中性蛋白酶,酶解2~3小时;然后降温至40~50℃,加入肽酶,酶解1~2小时;调节pH值至8~9,加入碱性蛋白酶,酶解2~3小时;灭活:升温至60~90℃保持10分钟,使酶灭活;采用离心机对鱼皮酶解液离心20~30分钟,收集酶解上清液;将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。本发明的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽可减轻早期膝骨关节炎的关节软骨退变,促进关节软骨的修复。
【专利说明】
一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生化技术技术领域,特别涉及一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 膝骨关节炎(Knee 0steoarthritis,K0A)是一种退行性关节疾病,是由滑膜关节 的退变引起的以关节疼痛、僵硬和活动受限为特征的关节病变。据调查显示,约33%的60岁 以上成人膝关节X线提示有K0A表现,其中有临床症状的约早期主要表现为 关节疼痛,晚期导致关节功能障碍甚至残疾,往往需要全关节置换,给社会和家庭造成了沉 重的负担。关节软骨是维持关节正常功能不可缺少的部分,0A最早累及关节软骨,但软骨早 期损伤易被忽视,由于软骨自我修复能力有限,易导致软骨不可逆性损伤。
[0003] 胶原蛋白是关节软骨的重要组成部分,具有促进骨形成、促进皮肤胶原代谢、对关 节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用。但目前利用蛋白酶酶解胶原蛋白来制备的胶原 蛋白肽,其分子量不均一,而且具有独特胶原活性功能的胶原蛋白肽含量很少,从而影响了 胶原蛋白肽的生理活性功能。

【发明内容】

[0004] 本发明提供了一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽及其应用,解决现有的胶原蛋白肽生理活 性功能不佳的问题。
[0005] 为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
[0006] -种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成:
[0007] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0008] 2)酶解:加入鱼皮重量20~40%的水,混匀后升温至50~60°C,调节pH至7.0,加入 鱼皮重量0.1~0.2%的中性蛋白酶,50~60°C的条件下酶解2~3小时;然后降温至40~50 °C,加入鱼皮重量0.05~0.1 %的肽酶,40~50 °C条件下酶解1~2小时;调节pH值至8~9,加 入鱼皮重量〇. 05~0.1 %的碱性蛋白酶,40~50 °C条件下酶解2~3小时;
[0009] 3)灭活:升温至60~90°C保持10分钟,使酶灭活;
[0010] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心20~30分钟,收集酶解上清液;
[0011] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0012] 其中,优选地,所述碱性蛋白酶为alcalase或胰酶中的至少一种。
[0013] 其中,优选地,上述制备方法制得的固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽中羟脯氨酸的百分 含量大于5%,组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。
[0014] 本发明并提供了狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在制备对膝骨关节炎患者具有关节软骨修 复作用的药物中的应用。
[0015] 为了更好的理解本发明的实质,下面提供本发明狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对膝骨关节 炎患者关节软骨修复作用的MRI观察。
[0016] 实验目的
[0017] 观察本发明狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对膝骨关节炎患者关节关节软骨修复作用的MRI 表现,为临床防治骨性关节炎提供影像依据。
[0018] 实验材料
[0019] 1、药品与试剂
[0020] 狭鳕鱼皮胶原蛋白肽性能指标如表1所示:
[0021] 表1狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标
[0023] 2 仪器
[0024]数字X线影像成像(柯达7500,美国),3.0T超导核磁共振(菲利普ingenia,荷兰)。 [0025] 3研究对象
[0026] 3.1病例纳入标准:
[0027] 3.1.1膝关节骨性关节炎诊断标准[1](参照《骨关节炎诊治指南》2007年版):
[0028]①近1个月内反复膝关节痛;
[0029] ②X线片(站立或负重位)示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和(或)囊性变、关节缘骨 赘形成;
[0030] ③关节液(至少2次)清亮、稀稠,WBC〈2000个/ml;
[0031] ④中年患者(40岁〈年龄〈60岁);
[0032] ⑤晨僵小于或等于30min;
[0033]⑥活动时有骨摩擦音(感)。
[0034]结合临床症状、实验室、X线检查,符合①②条或①③⑤⑥条或①④⑤⑥条,
[0035]可诊断为膝关节骨性关节炎。
[0036] 3.1.2膝节 X线的 Kellgren/Lawrence 评分标准:
[0037] I级:关节间隙可疑变窄,可能有骨赘;
[0038] n级:有明显骨赘,关节间隙可疑变窄;
[0039] m级:中等量骨赘,关节间隙变窄较明确,有硬化性改变;
[0040] IV级:大量骨赘,关节间隙明显变窄严重硬化性病变及明显畸形。
[0041 ] 3.1.3纳入标准:
[0042] ①符合膝关节骨性关节炎诊断标准的①④⑤⑥条;
[0043] ②X检查Kellgren/Lawrence分级0_n 级;
[0044] ③年龄:40-60 岁;
[0045] ④实验前患者血常规,肝、肾功、血糖,1^431?、〇^、430,心电图等检查结果正常 者;
[0046]⑤未接受NSAIDS药物和激素类药物治疗,并且未使用与本病相关的药物治疗患 者。
[0047] 3.2排除标准:
[0048] ①不符合上述纳入标准者;
[0049] ②同时患有其他风湿及代谢疾病患者,如痛风、类风湿性关节炎、糖尿病等;
[0050] ③伴有化脓性、非特异性等膝关节感染性炎症患者;
[0051] ④同时伴有创伤性滑膜炎、绒毛结节色素沉着性滑膜炎等以膝关节滑膜为主要病 变的患者;
[0052]⑤关节液呈粉红色或其它颜色、混浊、白细胞计数>1000个/mm3或见晶体者;
[0053] ⑥血 RF > 30 IU/ml、ESR > 20mm/h、CRP > 1 Omg/L 者;
[0054] ⑦合并患有严重的心脑血管、肝、肾等内科原发疾病及精神病患者;
[0055] ⑧依从性差,不能积极配合检查及治疗的患者。
[0056] 三、实验方法
[0057] 1病例选择和给药方法
[0058]根据上述纳入和排除标准选择19例患者,其中I级8例,II级11例;男2例,女17例, 平均年龄53.45岁。患者口服狭鳕鱼皮胶原蛋白肽5g bid,连续服用12周。
[0059] 2观测指标MRI检查
[0060]患者服药前及服药第13周,采用3.0T超导核磁共振仪对病变侧膝关节行扫描检 查。所有检查者MRI检查前3小时内均无剧烈运动,且均静坐休息半小时后扫描,并签署知情 同意书。
[0061] 扫描方法:采用Philip3.0T ingenia超导磁共振扫描和膝关节正交线圈。双膝屈 曲10°,患肢外旋10°~15°,仰卧位足先进。3plane定位扫描后,行矢状面、冠状面和横断面 扫描。扫描序列为:快速自旋回波T1加权(TSE-T1WI)脂肪抑制质子密度加权成像(PDWI-FS) (表2)
[0062] 表2 MRI不同序列的扫描参数
[0064] 3观测指标
[0065] ICRS分级与评分:关节软骨损伤的MRI分级标准参照国际软骨修复协会 (International Cartilage Repair Society,ICRS)分级标准,由两位骨放射医师(具有5 年以上工作经验)对MRI常规序列图像进行独立评估。评分范围1-5分,反应软骨的损伤程 度,〇级为5分,I级为4分,n级为3分,m级为2分,IV级为1分,分数越高意味着软骨损伤越 轻,具体评分标准见表3。
[0066] 表3 ? ICRS分级标准
[0068] 4 ?统计学处理
[0069] 采用GraphPad Prism 5统计软件进行资料分析,统计资料以x±S:表示,服药前后 ICRS评分采用成对t检验进行统计学分析,以P<0.05为有统计学意义。
[0070]四、结果
[0071]狭鳕鱼皮胶原蛋白肽5g bid,口服治疗12周后,19例膝骨关节炎患者中12例(15部 位)MRI扫描结果显示软骨表面退化程度减轻,软骨厚度增加,其中10例单部位好转,1例3部 位好转,1例2部位好转,有效率63.2% (12/19),按部位计算为78.9% (15/19),无变化的7例 中4例临床症状明显减轻(表4、5)。治疗后1〇?评分由1.895±0.9366降至1.158±0.8342, 与治疗前相比有显著差异(P〈〇.〇l)(表6和图1-3)。以上结果证实狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在5g bid的剂量下连续口服12周,对膝骨关节炎患者可延缓关节软骨的退变,促进软骨修复,减 轻关节炎的严重程度。
[0072]表4.狭鳕鱼皮胶原蛋白肽治疗后12例(15部位)有效患者MRI分级变化
[0075]表5.狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对膝骨关节炎患者ICRS分级的影响(n = 19, T夂SO)
[0077]表6.狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对膝骨关节炎患者ICRS评分的影响(n = 19,Y±?)
[0079] 和治疗前相比,林P〈0.01。
[0080] 五、讨论
[0081] 膝骨关节炎(Knee 0steoarthritis,K0A)是一种退行性关节疾病,是由滑膜关节 的退变引起的以关节疼痛、僵硬和活动受限为特征的关节病变。据调查显示,约33%的60岁 以上成人膝关节X线提示有K0A表现,其中有临床症状的约早期主要表现为 关节疼痛,晚期导致关节功能障碍甚至残疾,往往需要全关节置换,给社会和家庭造成了沉 重的负担。关节软骨是维持关节正常功能不可缺少的部分,0A最早累及关节软骨,但软骨早 期损伤易被忽视,由于软骨自我修复能力有限,易导致软骨不可逆性损伤。胶原蛋白是关节 软骨的重要组成部分,具有促进骨形成、促进皮肤胶原代谢、对关节炎等胶原病具有很好的 预防及治疗作用。本研究的病例选择是根据膝骨性关节炎诊断标准(骨关节炎诊治指南, 2007年版),制定严格的纳入标准和排除标准,筛选符合条件的患者19例;并按照Kellgren/ Lawrence分级标准分为I-II级。患者口服狭鳕鱼皮胶原蛋白肽10g/d连续服用12周,观察治 疗前后膝关节的影像学变化,为临床治疗和预后分析提供依据。
[0082] MRI不仅可以精确显示关节软骨的病理变化,而且可以在软骨发生病理形态学改 变之前及时发现其基质成分变化,从而对膝骨关节炎的软骨损害进行早期诊断。MRI与病理 对照MRI的符合率为81.3%,灵敏度为85.2%,特异度为76.0%,MRI对软骨损伤有较高的特 异性和敏感性。本研究采用快速自旋回波h加权(TSE-TWI)脂肪抑制质子密度加权成像 (PDWI-FS),对19例Kellgren/Lawrence分级为I-n级的膝关节进行扫描,获得了清晰的图 像,证实MRI可以早期观察骨性关节炎患者关节软骨的变化,并结合国际软骨修复委员会 (ICRS)分级标准进行评分作为临床治疗效果观察指标。
[0083]胶原蛋白是关节软骨的重要组成部分,具有促进骨形成、促进皮肤胶原代谢、对关 节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用,服用胶原蛋白多肽能显著改善膝关节疼痛,胶 原蛋白多肽治疗骨关节炎安全有效。本研究筛选Kellgren/Lawrence分级为I-II级膝骨关 节炎患者19例,口服狭鳕鱼皮胶原蛋白肽10g/d连续服用12周,观察患者的MRI改善情况,实 验结果发现19例中12例(15部位)MRI显示软骨分级下降,有效率63.2% (12/19),按部位计 算为 78.9%(15/19)。
[0084] ICRS分级标准是国际软骨修复协会制订的软骨损伤分级标准,根据软骨在MRI影 像中的分级进行评分,评分范围1-5分,反应软骨的损伤程度,0级为5分,1级为4分,2级为3 分,3级为2分,4级为1分,分数越高意味着软骨损伤越轻,根据服药前后评分变化可以反映 软骨修复程度,本组治疗后ICRS评分均值由1.90 ± 0.94降至1.16 ± 0.83,成对样本t检验p〈 0.01,说明狭鳕鱼胶原蛋白肽可通过延缓关节软骨的变性,促进软骨修复,从而减轻关节炎 的严重程度。
[0085]六、结论
[0086]本发明的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在5g bid的剂量下连续口服12周,可减轻早期膝骨 关节炎的关节软骨退变,促进关节软骨的修复。
【附图说明】
[0087]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0088] 图1为狭鳕鱼皮胶原蛋白肽对膝骨关节炎患者ICRS评分影响的柱状图;
[0089] 图2为膝骨关节炎患者MRI扫描结果(左胫骨外侧平台由II级变I级,股骨内髁软骨 由I级变为〇级);
[0090] 图3为膝骨关节炎患者MRI扫描结果(股骨内侧髁治疗后由I级变为0级,股骨水肿 信号消失)。
【具体实施方式】
[0091 ]下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的内容仅仅是本发 明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0092] 实施例1
[0093] 本实施例提供一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制 备而成:
[0094] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0095] 2)酶解:加入鱼皮重量30%的水,混匀后升温至55°C,调节pH至7.0,加入鱼皮重量 0.15%的中性蛋白酶,50~60°C的条件下酶解2.5小时;然后降温至40~50°C,加入鱼皮重 量0.08%的肽酶,40~50 °C条件下酶解1.5小时;调节pH值至8.5,加入鱼皮重量0.07 %的碱 性蛋白酶,40~50 °C条件下酶解2.5小时;
[0096] 3)灭活:升温至75°C保持10分钟,使酶灭活;
[0097] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心25分钟,收集酶解上清液;
[0098] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0099] 其中,碱性蛋白酶为alcalase。
[0100] 本实施例制得的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标如下所示:
[0102] 实施例2
[0103] 本实施例提供一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制 备而成:
[0104] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0105] 2)酶解:加入鱼皮重量20%的水,混匀后升温至60°C,调节pH至7.0,加入鱼皮重量 0.1 %的中性蛋白酶,50~60 °C的条件下酶解3小时;然后降温至40~50°C,加入鱼皮重量 0.051 %的肽酶,50°C条件下酶解1小时;调节pH值至9,加入鱼皮重量0.05%的碱性蛋白酶, 40~50 °C条件下酶解3小时;
[0106] 3)灭活:升温至60°C保持10分钟,使酶灭活;
[0107] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心20分钟,收集酶解上清液;
[0108] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0109] 其中,碱性蛋白酶为胰酶。
[0110] 本实施例制得的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标如下所示:
[0112] 实施例3
[0113] 本实施例提供一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制 备而成:
[0114] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0115] 2)酶解:加入鱼皮重量40%的水,混匀后升温至50~60°C,调节pH至7.0,加入鱼皮 重量〇. 1 %的中性蛋白酶,50~60°C的条件下酶解2小时;然后降温至40~50°C,加入鱼皮重 量0.1 %的肽酶,40~50 °C条件下酶解1小时;调节pH值至9,加入鱼皮重量0.05 %的碱性蛋 白酶,40~50 °C条件下酶解3小时;
[0116] 3)灭活:升温至90°C保持10分钟,使酶灭活;
[0117] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心20~30分钟,收集酶解上清液;
[0118] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0119]碱性蛋白酶为胰酶。
[0120]本实施例制得的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标如下所示:

[0123] 实施例4
[0124] 本实施例提供一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制 备而成:
[0125] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0126] 2)酶解:加入鱼皮重量35%的水,混匀后升温至50~60°C,调节pH至7.0,加入鱼皮 重量0.13%的中性蛋白酶,50~60°C的条件下酶解3小时;然后降温至40~50°C,加入鱼皮 重量0.07 %的肽酶,40~50°C条件下酶解1小时;调节pH值至8,加入鱼皮重量0.09%的碱性 蛋白酶,40~50 °C条件下酶解2.5小时;
[0127] 3)灭活:升温至80°C保持10分钟,使酶灭活;
[0128] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心30分钟,收集酶解上清液;
[0129] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0130] 碱性蛋白酶为alcalase或胰酶中的至少一种。
[0131] 本实施例制得的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标如下所示:
[0133] 实施例5
[0134] 本实施例提供一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制 备而成:
[0135] 1)原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎;
[0136] 2)酶解:加入鱼皮重量25%的水,混匀后升温至50~60°C,调节pH至7.0,加入鱼皮 重量0.12 %的中性蛋白酶,50~60 °C的条件下酶解2.5小时;然后降温至40~50°C,加入鱼 皮重量0.09 %的肽酶,40~50°C条件下酶解1.5小时;调节pH值至8.7,加入鱼皮重量0.06 % 的碱性蛋白酶,40~50 °C条件下酶解2.5小时;
[0137] 3)灭活:升温至70°C保持10分钟,使酶灭活;
[0138] 4)固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心24分钟,收集酶解上清液;
[0139] 5)真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。
[0140] 其中,碱性蛋白酶为alcalase和胰酶的混合物,二者的质量比为1:4.
[0141] 本实施例制得的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽理化指标如下所示:
[0143]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精 神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,其特征在于,它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而 成: 1) 原料预处理:将鱼皮清洗,沥干鱼皮表面的水,然后将鱼皮粉碎; 2) 酶解:加入鱼皮重量20~40%的水,混匀后升温至50~60°C,调节pH至7.0,加入鱼皮 重量0.1~0.2 %的中性蛋白酶,50~60 °C的条件下酶解2~3小时;然后降温至40~50 °C,加 入鱼皮重量〇. 05~0.1 %的肽酶,40~50°C条件下酶解1~2小时;调节pH值至8~9,加入鱼 皮重量〇. 05~0.1 %的碱性蛋白酶,40~50 °C条件下酶解2~3小时; 3) 灭活:升温至60~90 °C保持10分钟,使酶灭活; 4) 固液分离:采用离心机对鱼皮酶解液离心20~30分钟,收集酶解上清液; 5) 真空干燥:将滤液进行真空干燥,即得固态狭鳕鱼皮胶原蛋白肽。2. 根据权利要求1所述的一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,其特征在于,所述碱性蛋白酶为 alcalase或胰酶中的至少一种。3. 根据权利要求1所述的一种狭鳕鱼皮胶原蛋白肽,其特征在于,制得的固态狭鳕鱼皮 胶原蛋白肽中羟脯氨酸的百分含量大于5%,组分中分子量小于3000Da的占组分总数的 75%以上。4. 权利要求1的狭鳕鱼皮胶原蛋白肽在制备对膝骨关节炎患者具有关节软骨修复作用 的药物中的应用。
【文档编号】C12P21/06GK105821109SQ201610329471
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】韩彦弢, 苗德森, 赵晨懿, 王春波, 张德岩, 赵永强
【申请人】青岛海博瑞克生物科技有限公司
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