一种马尿酸盐培养基及其制备方法及茚三酮试剂及β溶血B族链球菌的鉴定方法
【专利摘要】本发明提供一种马尿酸盐培养基，该培养基包括蛋白胨、糖类营养成分、氯化钠、磷酸氢二钠和马尿酸盐，该马尿酸盐培养基能为β溶血B族链球菌的生长提供营养，使得马尿酸水解实验结果准确。本发明同时提供该马尿酸盐培养基的制备方法。本发明还提供一种茚三酮试剂，包括茚三酮、无水乙醇，该茚三酮试剂制备过程简单。本发明还提供一种β溶血B族链球菌的鉴定方法，其使用本发明提供的马尿酸盐培养基和茚三酮试剂，鉴定结果准确，避免了假阴性结果的出现。
【专利说明】
一种马尿酸盐培养基及其制备方法及茚三酮试剂及β溶血B族链球菌的鉴定方法
技术领域
[0001]本发明属于包含微生物的测定方法及其所用培养基，具体地，本发明涉及一种马尿酸盐培养基及β溶血B族链球菌的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]马尿酸钠水解实验用来测定细菌水解马尿酸的能力，用于初步鉴定β溶血性B族链球菌。
[0003]马尿酸(N-苯甲酰甘氨酸，苯甲酰氨基乙酸)是甘氨酸的苯甲酸衍生物，是一种与甘氨酸结合的芳香环化合物，它是一种酰胺，易溶解于水，通过特异的马尿酸水解酶催化作用，最终生成苯甲酸和甘氨酸。
[0004]马尿酸钠的水解可由茚三酮法检测产物甘氨酸。茚三酮[C6H4(CO3).H2O]是一种强氧化剂，甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应生成氨、二氧化碳和相应的醛，而茚三酮则生成还原型茚三酮。反应过程中生成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，则形成紫色化合物。
[0005]由茚三酮法检测产物甘氨酸，目前所用培养基为1%马尿酸钠水溶液(Difco)(马尿酸钠lg，蒸馏水100ml)。细菌在1%马尿酸钠水溶液中生长较缓慢，使用茚三酮溶液检测产物，会出现假阴性结果，试验结果不正确。
【发明内容】
[0006]为了克服以上现有技术中的技术问题，本发明提供一种马尿酸盐培养基，该培养基为β溶血性B族链球菌的生长提供需要的营养成分，同时不与茚三酮反应，避免假阴性结果出现，明确检测细菌分解马尿酸的能力。同时，该方法可方便地将马尿酸钠水解实验加入细菌生化鉴定板中，增加升华鉴定板鉴定细菌的能力，给半自动、自动仪器读取马尿酸钠水解实验结果提供方便。
[0007]为了达到以上目的，本发明采取如下技术方案:一种马尿酸盐培养基，包括马尿酸盐，还包括蛋白胨、糖类营养成分、氯化钠、缓冲液。
[0008]优选的是，按浓度百分比计，马尿酸盐培养基包括0.05-0.15%蛋白胨、0.3?0.9%糖类营养成分、0.3?0.9%氯化钠、0.03-0.07%缓冲液、1.5?4.5%马尿酸钠。
[0009]上述任一方案优选的是，所述糖类营养成分包括葡萄糖和/或蔗糖。
[0010]上述任一方案优选的是，所述缓冲液包括磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾。
[0011]该马尿酸盐培养基能为β溶血性B族链球菌的生长提供需要的营养成分，β溶血性B族链球菌能够很好的生长，同时不与茚三酮反应，能避免假阴性结果出现，能准确、明确鉴定β溶血性B族链球菌。
[0012]另一方面，本发明提供一种如上所述的马尿酸盐培养基的制备方法，包括以下步骤: A.称取原料并溶解得到溶液；
B.调节溶液的pH至7.8;
C.将步骤B中得到的溶液加入培养容器中；
D.将步骤C中得到的培养容器进行干燥；
E.将步骤D中得到的培养容器进行灭菌。
[0013]优选的是，步骤D中采用烘干进行干燥。
[0014]上述任一方案优选的是，所述烘干温度为30-60°C。
[0015]上述任一方案优选的是，所述烘干温度为45°C。
[0016]上述任一方案优选的是，步骤D中，采用辐照进行灭菌。
[0017]上述任一方案优选的是，所述辐照的辐照计量为SkGy。
[0018]上述任一方案优选的是，所述制备方法还包括将培养容器进行包装后灭菌。
[0019]上述任一方案优选的是，所述培养容器是指生化板中的一个或多个生化孔。这有利于将马尿酸钠水解实验加入细菌生化鉴定板中，增加生化鉴定板鉴定细菌的能力，给半自动、自动仪器读取马尿酸钠水解实验结果提供方便。
[0020]上述任一方案优选的是，步骤C中，每个所述生化孔中加入步骤B中得到的溶液50微升。
[0021]上述任一方案优选的是，所述制备方法还包括对加入所述马尿酸盐培养基的生化孔进行标注，以便进行识别。
[0022]本发明提供的马尿酸盐培养基的制备方法，制备得到的马尿酸盐培养基，能够很好为β溶血性B族链球菌提供营养，使得β溶血性B族链球菌在该马尿酸盐培养基中能很好的生长，生长状况良好，进而使得马尿酸钠水解实验结果准确，避免假阴性。
[0023]第三方面，本发明提供一种茚三酮试剂，包括茚三酮，还包括无水乙醇。
[0024]优选的是，所述茚三酮试剂，按浓度百分比计，包括茚三酮2%?7%。
[0025]上述任一方案优选的是，所述茚三酮的浓度百分比为3%?5%。
[0026]上述任一方案优选的是，所述茚三酮的浓度百分比为3.5%。
[0027]上述任一方案优选的是，所述茚三酮试剂还包括蒸馏水，用于定容。
[0028]上述任一方案优选的是，无水乙醇用于溶解茚三酮。
[0029]本发明提供的茚三酮试剂，配制过程简单，采用无水乙醇将茚三酮溶解后，采用蒸馏水进行定容即可，简单、易操作。
[0030]第四方面，本发明提供一种β溶血B族链球菌的鉴定方法，包括用马尿酸盐培养基培养细菌，然后加入茚三酮试剂，观察结果，其中，所述马尿酸盐培养基为本发明第一方面所述的马尿酸盐培养基。
[0031]优选的是，所述马尿酸盐培养基通过本发明第二方面所述制备方法制备得到。
[0032]上述任一方案优选的是，所述茚三酮试剂是本发明第三方面提供的茚三酮试剂。
[0033]上述任一方案优选的是，所述鉴定方法包括如下顺序实施的步骤: i.将菌悬液加入所述马尿酸盐培养基中，进行细菌培养；
i1.向培养后的细菌中加入所述茚三酮试剂，并观察显色结果。
[0034]上述任一方案优选的是，所述步骤i中，所述菌悬液用接种24小时的链球菌配制浓度为0.5麦氏浓度。
[0035]上述任一方案优选的是，所述步骤i中，每个所述生化孔中加入150微升所述菌悬液。
[0036]上述任一方案优选的是，所述步骤i中，细菌在35?37°C下培养。
[0037]上述任一方案优选的是，所述细菌在培养箱内培养。
[0038]上述任一方案优选的是，所述细菌培养18-24小时。
[0039]上述任一方案优选的是，所述步骤ii中，加入茚三酮试剂后，五分钟后进行显色结果观察。一般更短的时间时，即会出现颜色反应，为了避免假阴性，将判读时间延长到五分钟，可避免假阴性结果。
[0040]上述任一方案优选的是，所述步骤ii中，每个所述生化孔里加入50?100微升茚三酮试剂。
[0041]观察显色结果时，若出现紫蓝色，说明马尿酸盐水解为阳性，即受检细菌为β溶血B族链球菌；如反应无颜色反应，说明马尿酸盐水解为阴性，即受检细菌不是β溶血B族链球菌。
[0042]本发明提供的β溶血性B族链球菌鉴定方法，结果准确，能有效避免假阴性结果的出现，并且能实现半自动。
[0043]自动化。
【具体实施方式】
[0044]为了更加清楚、正确地理解本发明的
【发明内容】
，下面结合具体实施例对本发明的
【发明内容】
进一步做说明、解释。
[0045]实施例1
一种马尿酸盐培养基，由以下组成构成:
蛋白胨0.05g
葡萄糖0.3g
氯化钠0.3g
磷酸氢二钠 0.03g 马尿酸钠 1.5g 蒸馈水100ml。
[0046]换算成浓度百分比=质量/体积X100%，如下:
蛋白胨0.05%
葡萄糖0.3%
氯化钠0.3%
磷酸氢二钠 0.03%
马尿酸钠 1.5%。
[0047]本实施例中，该马尿酸盐培养基通过以下方法制备得到:
首先:按照以上组成称取原料并溶于10ml蒸馏水中；
第二步:米用 Imol/LNaOH 及 lmol/LHCl 调节 pH 至 7.8 ；
第三步:将调节PH后的溶液50微升加入培养皿中；并在45 °C下进行烘干，干燥后，将培养皿包装并进行辐照灭菌，本实施例中，辐照计量为SkGy。
[0048]本实施例中，制备得到的马尿酸盐培养基可以储存备用，也可以立即使用，立即使用的情况下，该培养基可不进行包装。
[0049]该马尿酸盐培养基用于鉴定β溶血性B族链球菌的方法如下:用前一天接种的链球菌配制浓度为0.5麦氏单位的菌悬液;将150微升菌悬液加入到有菌悬液的培养基中，在35?37 °C的培养箱内培养18小时;然后，往培养基中加入茚三酮试剂，茚三酮的试剂的加入量为50?100微升(如果采用3ml滴管进行滴加，大约I?2滴)，五分后，进行颜色结果判读;若出现紫蓝色，说明马尿酸盐水解为阳性，即受检细菌为β溶血B族链球菌;如反应无颜色反应，说明马尿酸盐水解为阴性，即受检细菌不是β溶血B族链球菌。
[0050]其中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 7g
无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0051]制备茚三酮试剂时，优选将配制号的茚三酮试剂进行辐照灭菌，辐照剂量为8kGy。其中，无水乙醇的量以完全溶解茚三酮为准。
[0052]本实施例中，菌悬液选择化脓链球菌、肺炎链球菌、停乳链球菌，颜色反应结果为阴性;菌悬液选择无乳链球菌，颜色反应结果显示阳性。并且，进行多次平行试验，结果仍保持一致，准确率达到99.9%以上。
[0053]对比地，发明人采用不同浓度百分比(1%、3%、5%、10%、20%)的马尿酸钠溶液对无乳链球菌β溶血B族链球菌)进行培养，并采用茚三酮试剂检测产物甘氨酸，观察颜色反应结果，其他条件均相同，结果显示，在这些所有马尿酸钠溶液中，无乳链球菌生长特别缓慢，甚至不生长，最终颜色反应结果显示，无乳链球菌的鉴定准确率只有不到50%。
[0054]实施例2.1
一种马尿酸盐培养基，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的，马尿酸盐培养基，由以下组成构成:
蛋白胨0.08g
葡萄糖0.48g
氯化钠0.48g
磷酸氢二钠 0.04g 马尿酸钠 2.4g 蒸馈水100ml。
[0055]实施例2.2
一种马尿酸盐培养基，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的，马尿酸盐培养基，由以下组成构成:
蛋白胨0.15g
葡萄糖0.9g
氯化钠0.9g
磷酸氢二钠 0.07g 马尿酸钠 4.5g 蒸馈水100ml。
[0056]实施例2.3
一种马尿酸盐培养基，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的，马尿酸盐培养基，由以下组成构成:
蛋白胨0.1g
葡萄糖0.6g
氯化钠0.6g
磷酸氢二钠 0.05g 马尿酸钠 3g 蒸馈水100ml。
[0057]实施例2.4
一种马尿酸盐培养基，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的，马尿酸盐培养基，由以下组成构成:
蛋白胨0.12g
葡萄糖0.72g
氯化钠0.72g
磷酸氢二钠 0.06g 马尿酸钠 3.6g 蒸馈水100ml。
[0058]实施例2.5
一种马尿酸盐培养基，与以上基本相同，不同的是，所述磷酸氢二钠替换为磷酸氢二钾。
[0059]实施例2.6
一种马尿酸盐培养基，与以上基本相同，不同的是，所述葡萄糖替换为蔗糖。
[0060]实施例3.1
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 2g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0061]实施例3.2
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 3g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0062]实施例3.3
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 3.5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0063]实施例3.4
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 4g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0064]实施例3.5
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 4.5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0065]实施例3.6
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0066]实施例3.7
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 5.5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0067]实施例3.8
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 6g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0068]实施例3.9
一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 6.5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0069]实施例3.10 一种茚三酮试剂，与上述实施例所用茚三酮试剂基本相同，不同的是，本实施例中，茚三酮试剂由以下组成构成:
茚三酮 2.5g 无水乙醇 50ml 蒸馈水 50ml。
[0070]实施例4.1
一种马尿酸盐培养基的制备方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，实施第三步时，将50微升的pH为7.8的溶液加入生化杯中。
[0071]实施例4.2
一种马尿酸盐培养基的制备方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，实施第三步时，将50微升的pH为7.8的溶液加入生化鉴定板的生化孔中。本实施例的马尿酸盐培养基制备方法有利于将马尿酸盐水解实验加入细菌生化鉴定板中，增加生化鉴定板鉴定细菌的能力，给半自动、自动仪器读取马尿酸盐水解实验结果提供方便。
[0072]实施例5.1
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养时间为24小时。
[0073]实施例5.2
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养时间为20小时。
[0074]实施例5.3
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养时间为22小时。
[0075]实施例5.4
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养温度为35 °C。
[0076]实施例5.5
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养温度为36 °C。
[0077]实施例5.6
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，用马尿酸盐培养基培养细菌的时候，培养温度为37 °C。
[0078]实施例5.7
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮试剂的时候，采用3ml滴管滴加I滴，约50微升。
[0079]实施例5.8
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮试剂的时候，采用3ml滴管滴加2滴，约100微升。
[0080]实施例5.9
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮试剂的时候，加入60微升弗三酮试剂。
[0081]实施例5.10
一种β溶血B族链球菌鉴定方法，与上述实施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮试剂的时候，加入80微升茚三酮试剂。
[0082]需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
【主权项】
1.一种马尿酸盐培养基，包括马尿酸盐，其特征在于:还包括蛋白胨、糖类营养成分、氯化钠、缓冲液。2.如权利要求2所述的马尿酸盐培养基，其特征在于:按浓度百分比计，马尿酸盐培养基包括0.05-0.15%蛋白胨、0.3-0.9%糖类营养成分、0.3?0.9%氯化钠、0.03-0.07%缓冲液、1.5?4.5%马尿酸钠。3.—种如权利要求1-2中任一项所述的马尿酸盐培养基的制备方法，包括以下步骤: A.称取原料并溶解得到溶液； B.调节溶液的pH至7.8; C.将步骤B中得到的溶液加入培养容器中； D.将步骤C中得到的培养容器进行干燥； E.将步骤D中得到的培养容器进行灭菌。4.如权利要求3所述的马尿酸盐培养基的制备方法，其特征在于:所述培养容器是指生化板中的一个或多个生化孔。5.如权利要求3所述的马尿酸盐培养基的制备方法，其特征在于:所述制备方法还包括对加入所述马尿酸盐培养基的生化孔进行标注。6.一种茚三酮试剂，包括茚三酮，其特征在于:还包括无水乙醇。7.如权利要求6所述的茚三酮试剂，其特征在于:所述茚三酮试剂，按浓度百分比计，包括茚三酮2%?7%。8.—种β溶血B族链球菌的鉴定方法，包括用马尿酸盐培养基培养细菌，然后加入茚三酮试剂，观察结果，其特征在于:所述马尿酸盐培养基为权利要求1-2中任一项所述马尿酸盐培养基。9.如权利要求8所述的β溶血B族链球菌的鉴定方法，其特征在于:所述马尿酸盐培养基通过权利要求3-5中任一项所述制备方法制备得到。10.如权利要求9所述的β溶血B族链球菌的鉴定方法，其特征在于:所述茚三酮试剂是权利要求6-7中任一项所述的茚三酮试剂。
【文档编号】C12Q1/14GK105821115SQ201610319446
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】王娜, 庞超, 杨伟伟
【申请人】山东鑫科生物科技股份有限公司