一种大肠杆菌 o26、o45、o121血清型三重pcr检测试剂盒及其引物组的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌O26、O45、O121血清型检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒3对引物组能在同一反应体系能进行有效扩增。实验表明，本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O26、O45、O121血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O26、O45 O121血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，适用于食源性致病菌的初筛选，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
【专利说明】
一种大肠杆菌〇26、045、0121血清型三重PCR检测试剂盒及其 引物组
技术领域
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌026、045、0121血清型检测 试剂盒及其引物组。
【背景技术】
[0002] 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年 发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。 直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿 和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。产志贺氏毒素大肠杆菌是重要的食源性致病源，严 重危害公共健康。〇157:H7可以导致腹泻、出血性肠炎，尿毒血症等临床症状。近年来，产志 贺毒素而非0157的大肠杆菌，尤其是被美国农业部称为"the Big Six"的6种大肠杆菌在诸 多国家及地区暴发流行，严重威胁人类的健康，越来越受到世界各国的关注。"the Big Six"包括大肠杆菌026、045、0103、0111、0121、0145等6种血清型。
[0003] 据统计，在美国由non-0157 STEC引起的患病病例中，有71%是由026、045、0103、 0111、0121、0145血清型引起的。为了保障人类的健康和牛肉市场的正常供应，2011年9月， 美国农业部颁布了一项禁止出售带有大肠杆菌"the Big Six"（026、045、0103、0111、0121、 0145)牛肉制品的法令。基于我国目前掌握的食源性疾病和风险监测资料，对高危食品（牛 肉制品和即食果蔬)和高致病性血清型(〇157:H7)进行了严格的规定和限量要求，但未对其 他血清型的STEC作明确的要求。有助于开展大肠杆菌026,045,0103,0111,0121,0145血清 型风险监测和风险评估的检测技术相对滞后。
[0004] 大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原(0)、荚膜抗原(K)、鞭毛抗原(H)和菌毛抗原 (F)等，大肠杆菌表面抗原0-抗原是刺激机体产生先天性免疫和获得性免疫的重要毒力因 子，在大肠杆菌的致病性过程中起着重要的作用。针对于〇抗原的传统血凝试验是检测血清 型的主要方法，该方法费时、费力，PCR检测技术在大肠杆菌血清型检测过程得到发展和应 用，目前国内，针对〇26、045、0121血清型多重PCR检测方法还未见报道，因此，本发明研究人 员研究一种多重PCR检测方法应用于026、045、0121血清型的检测，该方法省时、省力、特异 性和敏感性高，适用于推广应用。
[0005] 本发明公开了一种大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒及其检测方法。本发 明所述试剂盒3对引物组能在同一反应体系能进行有效扩增。现有技术中虽然也有其它检 测试剂盒，但实验表明，本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方具有快速、敏感、 特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌〇26、045、0121血清分型检测 方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌026、045、0121血清型分型的检测需求，易于大范围 推广应用，适用于食源性致病菌的初筛选，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题寻找一种能够快速、准确、特异性和灵敏性高的大肠杆 菌026、045、0121血清型的引物组，实现对026、045、0121血清型的高通量检测，并组装成试 剂盒，便于推广应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测大肠杆菌026、045、0121血清型的 引物组，包括以下引物，其核苷酸序列分别为:026-F: 5 '-ITCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3 '， 026-R:5 '-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3 '；045-F:5 '-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '，045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '；012 卜F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '， 0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '；
[0008] 其特异性扩增的目的片段大小分别为:若电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌026 血清型；出现241bp条带为大肠杆菌045血清型；出现632bp条带为大肠杆菌0121血清型。
[0009] 所述引物组在制备检测大肠杆菌026、045、0121血清型试剂盒中的应用。
[0010] 4.在一些实施例中，所述大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒还含有商品化 的2XPCR反应液试剂。
[0011]另一方面，本发明还提供所述试剂盒在用于检测大肠杆菌026、045、0121血清型的 检测方法，大肠杆菌菌液或其DNA提取物作为模板，用所述的0抗原特异性引物进行PCR扩 增，对扩增产物进行检测，电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌026血清型；出现241bp条带 为大肠杆菌045血清型；出现632bp条带为大肠杆菌0121血清型。
[0012] 所述PCR反应体系为50yL时含有：2XPCRBuffer 25此、终浓度为10uM引物混合液5 此、模板1 yL、超纯水19uL。
[0013] PCR反应参数：95°C预变性 15min;95°C30s，55°Clmin 30s，72°Clmin 30s，30个循 环；72°C10min。
[0014]本发明所述试剂盒在用于检测大肠杆菌026、045、0121血清型的方法，包括下列步 骤：
[0015] 1)大肠杆菌模板的制备
[0016] 将待测大肠杆菌菌株菌液接种至商品化的VIB液体培养基，37°C过夜摇菌，取lmL 菌液，分别用煮沸法和商品化细菌基因组提取试剂盒，进行模板制备；
[0017] 2)特异性引物的制备所述的0抗原特异性引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R的使用浓度为10uM;引物稀释液置于-20°C保存备用，避免反复冻融；
[0018] 3)PCR反应体系的建立和扩增
[0019] 取PCR管，分别加2XPCR反应混合液25yL、引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R混合液5yL、模板1. OyL、超纯水19. OyL，混匀;PCR反应参数:95 °C预变性15min; 95 °C 30s，55 °C lmin30s，72 °C lmin30s，30 个循环；72 °C lOmin;
[0020] 4)PCR检测结果判定
[0021] 取lOyLPCR产物，点样于1.0 %琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳20min，于凝 胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结 果出现159bp条带为大肠杆菌026血清型；出现241bp条带为大肠杆菌045血清型；出现632bp 条带为大肠杆菌0121血清型。
[0022]大肠杆菌经典检测技术是血清凝集试验，缺点是交叉反应多，敏感性低。本发明基 于大肠杆菌0抗原基因，设计可以在同一检测体系进行以026、045、0121血清型大肠杆菌0抗 原基因的特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)判定该菌大肠杆菌的血清型。所述检测试剂 盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠 杆菌血清型检测方法上的不足，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济 效益。
【附图说明】
[0023] 图1大肠杆菌026、045、0121血清型PCR检测
[0024] 图2大肠杆菌026、045、0121血清型PCR检测试剂盒特异性测试
[0025] 图3以大肠杆菌培养物为模板的PCR检测试剂盒灵敏度测试
[0026] 图4以大肠杆菌基因组DNA为模板的PCR检测试剂盒灵敏度测试
【具体实施方式】
[0027] 下列实施例中所有的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业化途径得到。
[0028] 实施例1
[0029] 大肠杆菌026、045、0121血清型检测引物组的设计
[0030] 设计的3对血清型特异性引物。根据设计的引物组分别扩增159bp、241bp和632bp 的026、045、0121血清型特异性片段。
[0031] 2.大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒的制备
[0032] (1)大肠杆菌模板的制备
[0033]将大肠杆菌菌株接种至VIB液体培养基，37 °C增菌过夜。各取lmL菌液，制成模板备 用。
[0034] (2)特异性引物的制备
[0035]本试剂盒检测的大肠杆菌026、045、0121血清型特异性引物扩增的目的片段大小 分别为：15%?(026)、241&?(045)和632&?(0121)。各条引物使用浓度为10碰，引物稀释液置 于-20°C保存备用，避免反复冻融；可根据如下引物序列人工合成。：026-?:5'-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3'，026-R:5'-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3' ；045-F:5'_ CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '，045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '；0121-F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '，0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '；
[0036] (3)PCR反应体系的建立和扩增
[0037]取PCR管，取PCR管，分别加2 X PCR反应混合液25yL、引物0264、026-1?、0454、045-R、0121-F和0121-R混合液5yL、模板1. OyL、超纯水19. OyL，混匀;PCR反应参数:95 °C预变性 151^11;951€3〇8,55。(：11111113〇8,72。(：11111113〇8,30个循环 ；72。(：1〇111111;
[0038] (4)PCR检测结果判定
[0039] 取10yL PCR产物，点样于1.5 %琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳20min，于 凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现。
[0040]具体判定方法：电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌026血清型（图1第1泳道）；出 现241bp条带为大肠杆菌045血清型（图1第2泳道）；出现632bp条带为大肠杆菌0121血清型 (图1第3泳道)。
[0041 ] 3.大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒的特异性和敏感性评价
[0042]本实施例中对实施例1中制备的大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒特异 性、敏感性和重复性等主要特征分别进行了测评。
[0043] (1)试剂盒特异性试验
[0044] 选取大肠杆菌026、045、0121、0103、0145、0113、0111、0157、078、0101、鼠伤寒沙门 氏菌（CVCC3384)、肠炎沙门氏菌（CVCC1805)、鸡白痢沙门氏菌（CVCC519)、鸭沙门氏菌 (CAU0118)、禽巴氏杆菌(CVCC493)、鸡毒支原体(CVCC1651)、禽支原体(CVCC274)、金黄色葡 萄球菌(CVCC543)、禽波氏菌(ATCC菌株IPDH591-77)、猪2型链球菌。按照试剂盒使用说明操 作进行PCR，产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。大肠杆菌026、045、0121可扩增到特异性 条带，其它菌株的PCR结果均为阴性(如图2)，泳道1-20分别为:026、045、0121、0103、0145、 0113、0111、0157、078、0101、鼠伤寒沙门氏菌((^0：3384)、肠炎沙门氏菌((^0：1805)、鸡白 痢沙门氏菌（CVCC519)、鸭沙门氏菌（CAU0118)、禽巴氏杆菌（CVCC493)、鸡毒支原体 (CVCC1651)、禽支原体（CVCC274)、金黄色葡萄球菌（CVCC543)、禽波氏菌（ATCC菌株 IPDH591-77)、猪2型链球菌。
[0045] (2)以细菌培养物为模板的试剂盒灵敏度试验
[0046] 分别接种大肠杆菌026、045、0121至VIB液体培养基中，37°C增菌过夜，各取lmL菌 液，分别制备菌液，浓度为 1 〇6CFU/yL、105CFU/yL、104CFU/yL、10 3CFU/yL、102CFU/yL、1OCFU/y L、lCFU/yL。各吸取lyL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结果测定 试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌〇26、045、0121血清型检测方法可以检 测出100CFU的026和0121血清型大肠杆菌，能检测出10CFU的045血清型大肠杆菌(如图3)。
[0047] (3)以细菌基因组DNA为模板的试剂盒灵敏度试验
[0048] 分别接种大肠杆菌026、045、0121至VIB液体培养基中，37°C增菌过夜，各取lmL菌 液提取细菌基因组 DNA，分别稀释浓度为 100ngAiL、10ngAiL、lng/yL、500pgAiL、100pgAiL、 10pgAiL、lpg/yL。各吸取lyL加入PCR反应体系，按照试剂盒操作说明进行PCR，根据试验结 果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌〇26、045、0121血清型检测方法 可以检测出l〇pg的026、045、0121血清型大肠杆菌基因组DNA(如图4)
[0049] 通过条件优化，确定了最佳的PCR反应体系和反应参数，组装了大肠杆菌026、045、 0121血清型检测试剂盒。对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带，而 其他细菌标准菌株等对照样品均未扩增到，说明该试剂盒具有很好的特异性。灵敏性检测 表明，试剂盒具有较高的灵敏性，其最低检测灵敏度可达到10CFU细菌菌液及10pg细菌基因 组DNA。研究结果表明，本发明研制的大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒具有灵敏、 特异、快速的优点，为大肠杆菌〇26、045、0121血清型检测及流行病学调查提供了新的技术 手段。
[0050] 以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测大肠杆菌〇26、045、0121血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物， 其核苷酸序列分别为： 026-F:5 '-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3 '， 026-R:5 '-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3 '； 045-F:5 '-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '， 045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '； 0121-F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '， 0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '； 任选的，含有或者不含有其它引物。2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，大肠杆菌026、045、0121血清型特异性引 物扩增的目的片段大小分别为：159bp、241bp和632bp。3. 权利要求1或2所述引物组在制备检测大肠杆菌026、045、0121血清型试剂盒中的应 用。4. 一种含权利要求1或2所述引物组的大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒。5. 根据权利要求4所述的大肠杆菌026、045、0121血清型检测试剂盒，其特征在于，其还 含有商品化的2 XPCR反应液。6. 权利要求4-5任意一项所述试剂盒在检测大肠杆菌026、045、0121血清型中的应用， 其特征在于，所述应用中，采用先将待测大肠杆菌菌液或待测大肠杆菌的DNA提取物作为模 板，用所述引物进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现159bp条带为大肠杆菌 026血清型；出现241bp条带为大肠杆菌045血清型；出现632bp条带为大肠杆菌0121血清型； 优选的，所述的检测是非诊断目的的。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为50yL时含有：2XPCR Buffer 25yL、各条引物终浓度为1 OuM引物混合液5yL、模板lyL、超纯水19yL。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR反应参数:95°C预变性15min;95°C 30s，55°Clmin 30s，72°Clmin 3〇8,30个循环；72。(：1〇11^11。
【文档编号】C12Q1/68GK105821124SQ201610208130
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】王金良, 沈志强, 陈金龙
【申请人】山东省滨州畜牧兽医研究院