检测人pak2基因的表达水平的特异引物对及其应用
【专利摘要】本发明公开了检测人PAK2基因的表达水平的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对，由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有人基因组中引物PAK2?F和引物PAK2?R组成的引物对的靶序列；所述引物PAK2?F为序列表的序列1所示的单链DNA分子，所述引物PAK2?R为序列表的序列2所示的单链DNA分子。实验证明，本发明提供的特异引物对特异性好、灵敏度高、耗时短、操作简单且检测成本低，有助于临床结肠癌样品的检测和/或辅助性检测。
【专利说明】
检测人PAK2基因的表达水平的特异引物对及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测人PAK2基因的表达水平的特异引物对及 其应用。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界 处，以40~50岁年龄组发病率最高，男女之比为(2~3): 1。结肠癌发病率占胃肠道肿瘤的第 3位。临床检测方法一般有大便隐血(F0BT)试验、糖基抗原CA199、胃肠道CT检查、纤维胃镜 检查、乙状结肠镜检查等等，其灵敏度和特异性都不理想，因此，寻找新的结肠癌诊断标志 物至关重要。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了特异引物对甲。
[0005] 本发明所提供的特异引物对甲，由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成;所述特 异DNA片段中具有人基因组中引物PAK2-F和引物PAK2-R组成的引物对的靶序列；
[0006] 所述引物PAK2-F可为如下al)或a2):
[0007] al)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0008] a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相 同功能的DNA分子。
[0009] 所述引物PAK2-R可为如下a3)或a4):
[0010] a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0011] a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相 同功能的DNA分子。
[0012] 所述特异引物对甲具体可由所述引物PAK2-F和所述引物PAK2-R组成。
[0013] 上述任一所述特异引物对甲在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述 产品的功能可为如下bl)或b2)或b3)或b4):
[0014] bl)鉴定或辅助鉴定结肠癌；
[0015] b2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者；
[0016] b3)检测人PAK2基因；
[0017] b4)检测人PAK2基因的表达水平。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。
[0019] 本发明所提供的产品，其含有上述任一所述特异引物对甲；所述产品的功能可为 如下bl)或b2)或b3)或b4):
[0020] bl)鉴定或辅助鉴定结肠癌；
[0021] b2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者；
[0022] b3)检测人PAK2基因；
[0023] b4)检测人PAK2基因的表达水平。
[0024]所述产品中还可含有特异引物对乙；所述特异引物对乙的靶序列位于人的内参基 因中。
[0025] 上述产品中，所述内参基因可为人GAPDH基因、人0-actin基因或人18s-rRNA基因。
[0026] 上述产品中，所述特异引物对乙具体可由引物GAPDH-F和引物GAPDH-R组成；
[0027] 所述引物GAPDH-F可为如下cl)或c2):
[0028] cl)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
[0029] c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相 同功能的DNA分子。
[0030] 所述引物GAPDH-R可为如下C3)或c4):
[0031] c3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0032] c4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相 同功能的DNA分子。
[0033] 上述产品中还可包括具有如下fl)或f2)或f3)或f4)或f5)或f6)或f7)或f8)或f9) 或no)的数据处理和结论显示功能的装置：
[0034] fl)比较同一个体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待 测组织中所述人PAK2基因的表达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候选为肿瘤组 织，如果所述待测组织中所述人PAK2基因的表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织 不为或候选不为肿瘤组织；
[0035] f 2)比较同一个体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表 达量，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常组 织、则所述待测组织为或候选为肿瘤组织，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参 基因的相对表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织；
[0036] f3)比较同一待测患者中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因的表达量，如果 所述结肠组织中所述人PAK2基因的表达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选 为结肠癌患者；如果所述结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述非结肠组织以下、则 所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者；
[0037] f4)比较同一待测患者中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的 相对表达量，如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述非结肠 组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参 基因的相对表达量为所述非结肠组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者； [0038] f5)比较待测患者的结肠组织和正常人的组织中人PAK2基因的表达量，如果所述 待测患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者 为或候选为结肠癌患者;如果所述待测患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述 正常人的组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者；
[0039] f6)比较待测患者的结肠组织和正常人的组织中人PAK2基因参比内参基因的相对 表达量，如果所述待测患者的结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述 正常人的组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述待测患者的结肠组织中 人PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述正常人的组织以下、则所述待测患者不为或 候选不为结肠癌患者；
[0040] f7)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异引 物对甲进行PCR扩增的步骤；
[0041] f8)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异引 物对甲和所述特异引物对乙进行PCR扩增的步骤；
[0042] f9)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异引 物对甲进行RT-PCR扩增的步骤；
[0043] f 10)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异引 物对甲和所述特异引物对乙进行RT-PCR扩增的步骤。
[0044] 上述任一所述产品的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0045] 上述任一所述产品的制备方法包括el)或e2):
[0046] el)将上述任一所述特异引物对甲和上述任一所述特异引物对乙中的各引物分别 单独包装的步骤；
[0047] e2)将上述任一所述特异引物对甲中的各引物分别单独包装的步骤。
[0048] 用于检测人PAK2基因表达量的物质在制备用于诊断结肠癌的试剂盒中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0049] 上述应用中，所述"用于检测人PAK2基因表达量的物质"可为检测特异DNA片段的 物质;所述特异DNA片段中具有人基因组中引物PAK-F和引物PAK-R组成的引物对的靶序列。
[0050] 所述检测所述特异DNA片段的物质可为所述特异引物对甲。
[00511 为解决上述技术问题，本发明还提供了如下dl)或d2)或d3)或d4)或d5)或d6)或 d7)或d8)或d9)或dlO)的方法：
[0052] dl)鉴定或辅助鉴定待测组织是否为或候选为肿瘤组织的方法，包括检测同一个 体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测组织中所述人PAK2基因 的表达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候选为肿瘤组织，如果所述待测组织中 所述人PAK2基因的表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组 织；
[0053] d2)鉴定或辅助鉴定待测组织是否为或候选为肿瘤组织的方法，包括检测同一个 体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述待测组织 中所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候 选为肿瘤组织，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述正 常组织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织；
[0054] d3)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测同一待测患者 中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因的表达量，如果所述结肠组织中所述人PAK2基因 的表达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述结肠组 织中所述人PAK2基因的表达量为所述非结肠组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结 肠癌患者；
[0055] d4)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测同一待测患者 中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述结肠组织 中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选 为结肠癌患者;如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述非结肠 组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者；
[0056] d5)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测待测患者的结 肠组织和正常人的组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测患者的结肠组织中所述人 PAK2基因的表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果 所述待测患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述正常人的组织以下、则所述待 测患者不为或候选不为结肠癌患者；
[0057] d6)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测待测患者的结 肠组织和正常人的组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述待测患者的结 肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者 为或候选为结肠癌患者;如果所述待测患者的结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对 表达量为所述正常人的组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者；
[0058] d7)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述 特异引物对甲进行PCR扩增的步骤；
[0059] d8)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述 特异引物对甲和所述特异引物对乙进行PCR扩增的步骤；
[0060] d9)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述 特异引物对甲进行RT-PCR扩增的步骤；
[0061 ] d 10)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述 特异引物对甲和所述特异引物对乙进行RT-PCR扩增的步骤。
[0062]所述dl)或所述d2)中，所述肿瘤组织为结肠癌、卵巢癌、乳腺癌或肝癌组织。
[0063] 上述任一所述人PAK2基因的表达量高于所述正常组织，具体可为所述人PAK2基因 的表达量显著高于所述正常组织。
[0064] 上述任一所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常组织，具体可 为所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量显著高于所述正常组织。
[0065] 上述任一所述人PAK2基因的表达量高于所述非结肠组织，具体可为所述人PAK2基 因的表达量显著高于所述非结肠组织。
[0066] 上述任一所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述非结肠组织，具体 可为所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量显著高于所述非结肠组织。
[0067] 上述任一所述人PAK2基因的表达量高于所述正常人的组织，具体可为所述人PAK2 基因的表达量显著高于所述正常人的组织。
[0068] 上述任一人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常人的组织，具体可 为人PAK2基因参比内参基因的相对表达量显著高于所述正常人的组织。
[0069] 上述任一所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量具体可为所述人PAK2基因 的表达量与内参基因的表达量之比。
[0070] 上述任一所述人PAK2基因的表达量和上述任一所述内参基因的表达量均可为根 据标准曲线和CT值得到的拷贝数。
[0071 ] 上述任一所述内参基因可为人GAPDH基因、人0-&(^111基因或人18811?^基因。
[0072] 以上任一所述人PAK2基因的GenelD为5062。
[0073] 鉴于现有技术中检测结肠癌样品标志物的不足，本发明合成了检测内参基因（人 GATOH基因）和人PAK2基因的引物，通过调整两个基因的引物浓度和比例，优化PCR的反应体 系和反应条件，开发了一种用于检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒。本发明的试剂盒采 用双标准曲线法，通过构建人PAK2基因和人GAPDH基因的标准定量曲线，精确定量样本的人 GAPDH基因和人PAK2基因表达量，相比于以往的免疫组化方法，该试剂盒具有精度高，结果 便于判读等优点；加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验 条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。总之，使用本发明 提供的试剂盒对人PAK2基因的表达水平进行检测，特异性好、灵敏度高、耗时短(检测时间 约lOOmin)、操作简单且检测成本低，有助于临床结肠癌样品的检测和/或辅助性检测。
【附图说明】
[0074]图1为人PAK2基因的溶解曲线。
[0075]图2为人GAPDH基因的溶解曲线。
[0076] 图3为人PAK2基因和人GAPDH基因的扩增曲线。其中。左侧为人GAPDH基因的扩增曲 线，右侧为人PAK2基因的扩增曲线。
[0077] 图4为8位临床结肠癌患者人PAK2基因的相对表达量。
【具体实施方式】
[0078]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0079] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0080] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0081] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0082] TRIzol为上海捷瑞生物工程有限公司产品。ReverTranscript qPCR RT Kit为 Takara公司产品。qPCR Mix(2 X )为北京全式金生物技术有限公司产品。实时荧光PCR仪为 美国Applied Biosystems公司产品，产品型号为ABI7300或ABI7500。
[0083] 实施例1、检测人PAK2基因的相对表达量的试剂盒的制备
[0084] -、引物的合成
[0085] 检测人PAK2基因相对表达量的引物由引物PAK2-F、引物PAK2-R、引物GAPDH-F和引 物GATOH-R组成，各条引物均为单链DNA分子，它们的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、 序列2、序列3和序列4所示。
[0086] 引物PAK2-F:5'-AATGGCAGAITGGAGIT-3'（序列表中序列1);
[0087] 引物?厶1(2-1?:5'-06厶厶(：11^〇^〇^06厶厶-3'（序列表中序列2);
[0088] 引物GAPDH-F: 5 ' -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '（序列表中序列3);
[0089] 引物6厶?011-1?:5，-厶610：11'0^06厶1厶0^厶厶61'-3，（序列表中序列4)。
[0090] 人工合成引物PAK2-F、引物PAK2-R、引物GAPDH-F和引物GAPDH-R。
[0091 ]二、检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒的制备
[0092] 检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒为将TRIzol、氯仿、无水乙醇、 ReverTranscript qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液和阴性对照品组装在一起得到的产品 (TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTranscript qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液和阴性对照 品均为独立包装）；其中检测体系PCR反应液包括12.5yL qPCR Mix(2 X )、引物PAK2-F、引物 PAK2-R、引物GATOH-F和引物GATOH-R，用去离子水补至23yL;所述阴性对照品为不含人PAK2 基因的溶液(例如去离子水），使用时加入2yL。
[0093] 实施例2、实施例1制备的检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒的使用方法
[0094] 实施例1制备的检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒的使用方法如下：
[0095] 1、提取组织的总RNA
[0096] 提取组织的总RNA的步骤如下：
[0097] (1)取适量的新鲜组织，加入lmL TRIzol，研磨均匀；然后加入0.2mL氯仿，震荡均 匀，4。(：、14000rpm离心10min。
[0098] (2)完成步骤(1)后，将上层液相转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，上下充分 混勾，室温静置l〇min，4°C、14000rpm离心10min。
[0099] (3)完成步骤（2)后，弃上清，加入75 %乙醇水溶液（由蒸馏水和无水乙醇混合制 备）lmL，轻轻上下颠倒洗涤管壁，4°C、14000rpm离心5min。
[0100] (4)完成步骤(3)后，弃上清，室温干燥10~15min，然后加入20yL RNase-free水溶 解沉淀，即得到组织的总RNA。
[0101] 2、参考ReverTranscript qPCR RT Kit的说明书，将步骤1得到的组织的总RNA反 转为cDNA，得到组织的cDNA溶液，组织的cDNA溶液中DNA的浓度为50yg/yL。
[0102] 3、配置反应体系
[0103] (1)取步骤2得到的cDNA溶液，用去离子水稀释，依次得到DNA的浓度为lOyg/yL的 cDNA溶液1、DNA的浓度为2yg/iiL的cDNA溶液2、DNA的浓度为0.4yg/iiL的cDNA溶液3、DNA的浓 度为0.08iig/iiL 的cDNA 溶液 4、DNA 的浓度为0.016iig/iiL 的cDNA 溶液5。
[0104]向23yL检测体系PCR反应液中加入2yL模板溶液甲（cDNA溶液、cDNA溶液1、cDNA溶 液2、cDNA溶液3、cDNA溶液4或cDNA溶液5 )，得到反应体系1。
[0105] (2)向23yL检测体系PCR反应液中加入2yL步骤2得到组织的cDNA溶液，得到反应体 系3。
[0106] (3)向23yL检测体系PCR反应液中加入2yL去离子水，得到反应体系4(作为阴性对 照)。
[0107] (4)向23yL检测体系PCR反应液中加入2yL生理盐水，得到反应体系5(作为空白对 照)。
[0108] 上述各反应体系中，引物PAK2-F、引物PAK2-R、引物GATOH-F和引物GATOH-R的浓度 均为 0.2iiM。
[0109] 4、实时定量PCR检测
[0110] 将步骤3配制的各个反应体系在实时荧光PCR仪上进行实时定量PCR检测(步骤(2) 需检测三个平行样）。反应条件:95°C预变性lmin;95°C 15s，58°C35sec，40个循环，荧光信号 于58°C35sec时采集。
[0111] 使用该试剂盒得到的溶解度曲线和扩增曲线分别见图1、图2和图3。
[0112] 5、结果判断
[0113] 将阈值线调整至背景信号及阴性对照的扩增线以上，系统根据步骤3的（1)制备的 标准曲线和CT值自动计算出拷贝数(即基因表达量），进一步计算出人PAK2基因的相对表达 量，计算公式为：
[0114] 人PAK2基因的相对表达量=人PAK2基因的拷贝数/人GAPDH基因的拷贝数。
[0115] 实施例3、采用实施例1制备的检测人PAK2基因相对表达量的试剂盒检测临床标本
[0116] 取8位临床确诊为结肠癌患者（均为知情同意的志愿者）的结肠癌组织和癌旁组 织，按照实施例2的试剂盒使用方法进行检测。其中每个患者的结肠癌组织和癌旁组织需成 对检测。
[0117] 每个样本重复3次。
[0118] 实验结果如表1和图4所示。结果表明，8位临床结肠癌患者的人PAK2基因在结肠癌 组织中的表达量或相对表达量均显著高于癌旁组织，符合率为100%。因此实施例1制备的 试剂盒可用于临床结肠癌样本的检测或辅助性检测。
[0119]表1.临床结肠癌患者的样本检测结果
【主权项】
1. 特异引物对甲，由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成;所述特异DNA片段中具有 人基因组中引物PAK2-F和引物PAK2-R组成的引物对的靶序列； 所述引物PAK2-F为如下al)或a2): al)序列表的序列1所示的单链DNA分子； a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功 能的DNA分子； 所述引物PAK2-R为如下a3)或a4): a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功 能的DNA分子。2. 如权利要求1所述的特异引物对甲，其特征在于：所述特异引物对甲由所述引物 PAK2-F和所述引物PAK2-R组成。3. 权利要求1或2所述特异引物对甲在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下bl) 或b2)或b3)或b4): bl)鉴定或辅助鉴定结肠癌； b2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者； b3)检测人PAK2基因； b4)检测人PAK2基因的表达水平。4. 含有权利要求1或2所述特异引物对甲的产品；所述产品的功能为如下bl)或b2)或 b3)或b4): bl)鉴定或辅助鉴定结肠癌； b2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者； b3)检测人PAK2基因； b4)检测人PAK2基因的表达水平。5. 如权利要求4所述的产品，其特征在于:所述产品中还含有特异引物对乙；所述特异 引物对乙的靶序列位于人的内参基因中。6. 如权利要求5所述的产品，其特征在于：所述特异引物对乙由引物GAPDH-F和引物 GATOH-R 组成； 所述引物GAPDH-F为如下cl)或c2): cl)序列表的序列3所示的单链DNA分子； c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功 能的DNA分子； 所述引物GAPDH-R为如下c3)或c4): c3)序列表的序列4所示的单链DNA分子； c4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功 能的DNA分子。7. 如权利要求4至6任一所述的产品，其特征在于:所述产品还包括具有如下Π )或f 2) 或f3)或f4)或f5)或f6)或f7)或f8)或f9)或Π 0)的数据处理和结论显示功能的装置： Π )比较同一个体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测组 织中所述人PAK2基因的表达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候选为肿瘤组织， 如果所述待测组织中所述人PAK2基因的表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织不为 或候选不为肿瘤组织； f2)比较同一个体中的待测组织和正常组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达 量，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常组织、 则所述待测组织为或候选为肿瘤组织，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参基因 的相对表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织； f3)比较同一待测患者中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因的表达量，如果所述 结肠组织中所述人PAK2基因的表达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选为结 肠癌患者；如果所述结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述非结肠组织以下、则所述 待测患者不为或候选不为结肠癌患者； f4)比较同一待测患者中的结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对 表达量，如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述非结肠组 织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参基 因的相对表达量为所述非结肠组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者； f5)比较待测患者的结肠组织和正常人的组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测 患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者为或 候选为结肠癌患者;如果所述待测患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述正常 人的组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者； f6)比较待测患者的结肠组织和正常人的组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达 量，如果所述待测患者的结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常 人的组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述待测患者的结肠组织中人 PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述正常人的组织以下、则所述待测患者不为或候 选不为结肠癌患者； f7)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异引物对 甲进行PCR扩增的步骤； f8)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异引物对 甲和所述特异引物对乙进行PCR扩增的步骤； f9)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异引物对 甲进行RT-PCR扩增的步骤； Π 0)检测人PAK2基因的表达水平，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异引物对 甲和所述特异引物对乙进行RT-PCR扩增的步骤。8. 权利要求4至7任一所述的产品的制备方法，包括el)或e2): el)将权利要求1或2所述特异引物对甲和权利要求5或6所述特异引物对乙中的各引物 分别单独包装的步骤； e2)将权利要求1或2所述特异引物对甲中的各引物分别单独包装的步骤。9. 用于检测人PAK2基因表达量的物质在制备用于诊断结肠癌的试剂盒中的应用。10. (11)或(12)或(13)或(14)或(15)或(16)或(17)或(18)或(19)或(110): dl)鉴定或辅助鉴定待测组织是否为或候选为肿瘤组织的方法，包括检测同一个体中 的待测组织和正常组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测组织中所述人PAK2基因的表 达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候选为肿瘤组织，如果所述待测组织中所述 人PAK2基因的表达量为所述正常组织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织； d2)鉴定或辅助鉴定待测组织是否为或候选为肿瘤组织的方法，包括检测同一个体中 的待测组织和正常组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述待测组织中所 述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常组织、则所述待测组织为或候选为 肿瘤组织，如果所述待测组织中所述人PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述正常组 织以下、则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织； d3)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测同一待测患者中的 结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因的表达量，如果所述结肠组织中所述人PAK2基因的表 达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述结肠组织中 所述人PAK2基因的表达量为所述非结肠组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌 患者； d4)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测同一待测患者中的 结肠组织和非结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述结肠组织中人 PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述非结肠组织、则所述待测患者为或候选为结 肠癌患者;如果所述结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量为所述非结肠组织 以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者； d5)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测待测患者的结肠组 织和正常人的组织中人PAK2基因的表达量，如果所述待测患者的结肠组织中所述人PAK2基 因的表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者为或候选为结肠癌患者；如果所述待 测患者的结肠组织中所述人PAK2基因的表达量为所述正常人的组织以下、则所述待测患者 不为或候选不为结肠癌患者； d6)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为结肠癌患者的方法，包括检测待测患者的结肠组 织和正常人的组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量，如果所述待测患者的结肠组 织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达量高于所述正常人的组织、则所述待测患者为或 候选为结肠癌患者;如果所述待测患者的结肠组织中人PAK2基因参比内参基因的相对表达 量为所述正常人的组织以下、则所述待测患者不为或候选不为结肠癌患者； d7)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异 引物对甲进行PCR扩增的步骤； d8)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的cDNA为模板，采用所述特异 引物对甲和所述特异引物对乙进行PCR扩增的步骤； d9)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异 引物对甲进行RT-PCR扩增的步骤； dlO)检测人PAK2基因的表达水平的方法，包括以待测样本的RNA为模板，采用所述特异 弓丨物对甲和所述特异引物对乙进行RT-PCR扩增的步骤。
【文档编号】C12N15/11GK105821126SQ201610247507
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】张函槊, 李娟
【申请人】苏州吉诺瑞生物科技有限公司