一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，该方法利用连接酶连接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA模板，该模板可以引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏度的核酸检测，同时该方法能够特异性地区分含有单碱基差异的核酸。本发明首次提出通过高特异性的连接反应构建双茎环结构DNA，为下一步环介导等温扩增反应提供了特异性的扩增模板，该方法无需荧光标记，成本低廉，避免了PCR过程精确的热循环过程，在恒温条件下即可实现待测核酸的快速扩增。本发明能够用于RNA或DNA的定量分析、甲基化检测、SNP检测等，为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等研究提供了新的策略。
【专利说明】
一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于连接反应构建双茎环结构DNA 模板的方法，以及该方法在RNA定量检测、DNA定量检测、甲基化检测以及单碱基区分中的应 用。
【背景技术】
[0002] 随着人类基因组计划的完成和新一代高通量测序技术的不断发展，特定序列核酸 (DNA或RNA)的变异检测、DNA甲基化分析、microRNA表达分析的研究，已成为分子生物学领 域研究的热点。他们被作为基因标志物，用于疾病的病理研究、早期诊断及药物的研发。因 此，简便、快速、灵敏、具有单碱基识别能力的DNA或RNA检测及定量分析方法对生命基本过 程的深入研究，基因相关遗传性疾病及癌症发生的研究，疾病的早期诊断及治疗都有非常 重要的意义。往往这些基因标志物的少量变异便可能引起疾病的发生，因此在生物样品测 定中不仅需要分析方法具有潜在的信号放大能力即高灵敏度，同时更需要具有良好的识别 DNA或RNA中单碱基差异的能力即良好的选择性。
[0003] 目前以PCR为代表的核酸扩增技术是DNA和RNA检测及定量分析的重要手段。然而， PCR不仅需要精确的热循环，同时容易由引物二聚体产生假阳性的扩增信号，而且很难区分 DNA或RNA中的单碱基的差别。尽管等位基因特异性PCR被用于DNA单碱基差异的检测，然而 DNA聚合酶识别单碱基错配的特异性很难满足大量未突变碱基中少量的突变。随着分子生 物学的猛烈发展，以等温核酸扩增技术为基础的核酸检测技术相继建立，如链顶替核酸扩 增技术(SDA)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、切刻内切酶核酸等温扩增 技术(NEMA)等。这些技术摆脱了 PCR对精良仪器设备的依赖，使等温核酸扩增技术在临床和 现场快速诊断方面显示其突出的优越性，但在单碱基分辨能力上这些方法存在很多不足。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种以待测核酸序列为模板，利用连接酶连 接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA，以该双茎环结构DNA作为起 始模板引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏地检测核酸的方法，特别是 特异性地区分含有单碱基差异的核酸。
[0005] 解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
[0006] 1、根据待检测核酸序列，设计并合成具有茎环结构的探针A和探针B，其中探针A从 端到端依次为茎环区、检测识别区，探针B从端到端依次为检测识别区、茎环区且 其序列的5'端修饰磷酸基团，所述探针A和探针B的检测识别区是与待检测核酸互补的8~ 40个碱基序列。
[0007] 2、将探针A、探针B的检测识别区与待检测核酸杂交，然后通过连接酶将探针A和探 针B连接起来形成双茎环结构DNA。
[0008] 3、以双茎环结构DNA为模板进行环介导等温扩增反应，并加入SYBR Green I荧光 染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线即可实现核酸的检测及定量分析。
[0009] 上述的待检测核酸为RNA时，所述的连接酶为T4RNA连接酶2、T4DNA连接酶、T3DNA 连接酶中的任意一种，探针A和探针B的检测识别区优选与RNA互补的9~22个碱基序列。
[0010] 上述的待检测核酸为DNA时，所述的连接酶为ArrtpligaseK^稳定型DNA连接酶、 Taq DNA连接酶、9° N? DNA连接酶中的任意一种，探针A和探针B的检测识别区优选与DNA互 补的15~25碱基序列。
[0011] 上述的探针A和探针B进一步优选茎环区的茎的长度为5~18个配对的碱基序列， 茎环区的环的长度为15~35个碱基序列。
[0012]本发明的有益效果如下：
[0013] 1、本发明首次提出利用连接反应构建双茎环结构DNA模板，该方法不需要荧光标 记，成本低廉，检测不需要放射性元素标记，避免了对人体的放射性危害。
[0014] 2、本发明通过高特异性的连接反应构建的双莖环结构DNA为下一步环介导等温扩 增反应提供了特异性的扩增模板，可以实现RNA定量分析(如基因表达分析、microRNA表达 分析）、DNA定量分析、甲基化检测、SNP检测等。
[0015] 3、本发明的连接反应和环介导等温扩增反应均在离心管中依次完成，所建立的核 酸检测方法无需复杂的分离和洗涤步骤，减少了实验过程中试剂交叉污染的风险，简化了 实验操作步骤，提高了检测的灵敏度。该方法为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等的研 究提供了新的策略。
[0016] 4、本发明方法相对于PCR，克服了升降温过程耗时的缺点，实现了恒温条件下的信 号快速放大，具有高的灵敏度和扩增效率。
[0017] 5、本发明方法还可通过终点荧光检测、共振光散射检测、凝胶电泳检测等检测手 段进行RNA定量分析(如基因表达分析、microRNA表达分析）、DNA定量分析、甲基化检测、SNP 检测等。
【附图说明】
[0018]图1是探针A和探针B的结构示意图。
[0019] 图2是实施例1中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板定量检测microRNA的原理 示意图。
[0020] 图3是实施例1中荧光强度随着let_7a浓度变化的实时荧光曲线图。
[0021] 图4是实施例1中检测let_7a实时荧光曲线P0I值与let_7a浓度对数值的线性关系 图。
[0022]图5是实施例2中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测let-7家族的相对信 号强度图。
[0023]图6是实施例3中基于连接反应构建双茎环结构DNA模板定量检测p53基因DNA片段 的原理示意图。
[0024] 图7是实施例3中荧光强度随着DNA浓度变化的实时荧光曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0026] 实施例1
[0027] 以let-7a为microRNA分析模型，根据let-7a序列5' -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3 '，设计合成具有茎环结构的探针A和探针B，探针A的碱基序列为5 '-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAACTATACAAC-3'(由宝 生物工程（大连）有限公司提供）；探针B的碱基序列为5 '-CTACTACCTCATTTTATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3'(由宝 生物工程(大连)有限公司提供），其中探针B的5'端修饰磷酸基团。探针A和探针B的结构示 意图如图1所示。
[0028] 如图2所示，当存在let_7a时，探针A和探针B的检测识别区分别与let_7a特异性杂 交，以let-7a为模板，在T4RNA连接酶2催化作用下将探针A和探针B连接起来形成双茎环结 构DNA，该双茎环结构DNA可以作为环介导等温扩增反应的起始模板，引发扩增反应，产生大 量双链DNA，加入双链嵌合染料SYBR Green I，利用Step One实时定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）实时检测焚光信号，根据实时焚光曲线即可实现let_7a的定量分析。
[0029] 采用上述设计合成的具有茎环结构的探针A和探针B基于连接反应构建双茎环结 构DNA模板定量检测1 et_7a的具体方法如下：
[0030] 在200yL离心管中加入2 ? 3yL水、1 ? OyL 20nmo 1 /L探针A水溶液、1 ? 0yL20nmo 1 /L探 针B水溶液、0.2yL 40unit/yL RNase抑制剂、0.5yL T4RNA连接酶2反应缓冲溶液(500mmol/ L Tris-HCl、20mmol/L MgCl2、10mmol/L DTT、4mmol/L ATP，pH = 7.5,25°C)、1.0yL不同浓 度的let-7a水溶液，混合均匀，作为溶液I。
[0031] 在200yL离心管中加入3.4此水、0.5yL T4RNA连接酶2反应缓冲溶液（500mmol/L Tris-HCl、20mmol/L MgCl2、10mmol/L DTT、4mmol/L ATP，pH=7.5,25°C)、0.1yL T4RNA连 接酶2，混合均匀，作为溶液II。
[0032]将溶液I放入PCR仪中，先85°C加热2分钟，使探针A和探针B变性，再降温至39°C保 持5分钟，让探针A和探针B与let-7a杂交，再加入溶液II，39°C保持30分钟进行连接反应，形 成双茎环结构DNA。反应完后，取2. OyL连接反应产物加入到8. OyL环介导等温扩增反应混合 溶液中，其中环介导等温扩增反应混合溶液由2.5yL灭菌水、1. OyL ThermoPol反应缓冲溶 液（200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2S〇4,20mmol/L MgS〇4，l% 曲拉 通X-100，pH=8.8，25°C )、2. OyL 5mol/L甜菜碱水溶液、1. OyL 2.5mmol/L脱氧核苷三磷酸 (dNTP)水溶液、0.4yL 20_〇1/L FIP(CGACAGCAGAGGATITGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGA，由宝生 物工程（大连）有限公司提供）水溶液、0 ? 4 y L 2 0 y m o 1 / L B I P (ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶 液、0.5yL 8unit/yL Bst DNA聚合酶溶液、0.2yL SYBR Green I(4X)荧光染料组成，混合 均勾后立刻放到Step One实时定量PCR系统中（Applied Biosystems，美国），在65°C下进行 环介导等温扩增反应，间隔1分钟采集一次实时荧光强度信号。同时作空白对比实验，空白 是加入1.0此水来代替let_7a。检测结果见图3,并绘制检测let_7a的实时荧光曲线P0I值 (实时荧光强度曲线斜率最大点所对应的反应时间）与let_7a浓度对数值的线性关系曲线， 结果见图4。
[0033]从图3中可以看出，随着let_7a浓度的增加环介导等温扩增反应速度逐渐加快，也 就是说随着let-7a浓度的增加，基于连接反应构建的双茎环结构DNA模板越多，且不同浓度 梯度之间可以相互区分，同时，从图4中可以看出POI值与let_7a的浓度的对数值呈现良好 的线性关系，线性相关方程式为POI = _34.3-4.551gCiet-7a，相关系数R2 = 0.999。因此，本发 明方法可以定量检测低至l〇〇amol/L let-7a miRNA，同理，本发明方法也可以用于其他RNA 的定量检测。
[0034] 实施例2
[0035]人的let_7miRNA家族是只相差一个或几个碱基、高度同源的相似序列。利用实施 例1中针对1 e t - 7 a设计的探针A和探针B检测1 e t - 7家族中的1 e t - 7 b ( 5 '-UGAGGUAGUAGGUUGU⑶GGUU-3' ) Uet-TcG' -UGAGGUAGUAG⑶UGUAUGGUU-3' ) Uet-TcKS'-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3' ) -UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3')，检测方法是在 连接反应中分别用1 et_7b、1 e t_7c、1 et_7d、1 e t_7e来代替1 e t_7a，其他实验步骤与实施例1 相同，并分别测量其实时荧光曲线。Let_7b和let_7d与let_7a序列相差两个碱基，let_7c和 let_7e与let_7a序列相差一个碱基。检测结果如图5所示。由图5可见，let_7a能明显地与其 他let-7家族中的其它miRNA区分开，let-7b的非特异性干扰为4.6%，let-7c的非特异性干 扰为12.9%，let_7d的非特异性干扰为0.6%，let_7e的非特异性干扰为1%，表明本发明基 于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法可以应用于单碱基的区分。
[0036] 实施例3
[0037] 以人P53基因外显子8的突变型DNA片段为例，将突变型DNA(5/-TGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACTGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTC-3')作为检测目标序列，设计合 成具有茎环结构的探针A和探针B，探针A的碱基序列为5 '-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGCTCTTCCTCTGTGCGCCA-3 7 (由宝生物工程（大连）有限公司提供）；探针B的碱基序列为5 '-GTCTCTCCCAGGACAGGCATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3 7 (由宝生物工程(大连)有限公司提供），其中探针B的5'端为磷酸基团修饰。
[0038] 如图6所示，当存在检测目标DNA序列时，探针A和探针B的检测识别区分别与目标 DNA序列特异性杂交，以目标DNA序列为模板，在Ampligase?热稳定型DNA连接酶作用下，连 接探针A和探针B形成双茎环结构DNA，该双茎环结构DNA可以作为环介导等温扩增反应的模 板，加入双链嵌合染料SYBR Green I，利用Step One实时定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）实时检测焚光信号，根据实时焚光曲线即可实现目标DNA序列的检测。
[0039] 采用上述设计合成的具有茎环结构的探针A和探针B基于连接反应构建双茎环结 构DNA模板定量检测DNA的具体方法如下：
[0040] 在200yL离心管中加入5 ? 8yL水、1 ? OyL 20nmo 1 /L探针A水溶液、1 ? 0yL20nmo 1 /L探 针B水溶液、1.0此Amp丨igaseK热稳定型DNA连接酶反应缓冲溶液（200mmol/L Tris-HCl， 250mmol/L KCl，100mmol/L MgCl2,5mmol/L 0,0.1%曲拉通父-100，口11=8.3,25。(：）、0.24 L 5UAiLAmpligaseK热稳定型DNA连接酶、l.OyL不同浓度的目标DNA水溶液，混合均匀后放 入PCR仪中，先95°C加热5分钟，然后降温至65°C保持30分钟进行连接反应，形成双茎环结构 DNA。反应完后，吸取2.OyL连接反应产物加入到8. OyL环介导等温扩增反应混合溶液中，其 中环介导等温扩增反应混合溶液由2.5yL灭菌水、2 . OyL 5mol/L甜菜碱水溶液、1. OyL 2.5mmol/L dNTP水溶液、0.4yL 20_〇1/L FIP水溶液、0.4yL20_ol/L BIP水溶液、0.2yL SYBR Green I(4X)荧光染料、0.5yL 8U/yL Bst DNA聚合酶溶液、l.OyL ThermoPol反应缓 冲溶液（200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2S〇4,20mmol/L MgS〇4，l% 曲拉通X-100，pH = 8.8，25°C )组成，混合均匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中 (Applied Biosystems，美国），在65°C下进行环介导等温扩增反应，间隔1分钟采集一次实 时荧光强度信号。同时作空白对比实验，空白是加入1.0此水来代替目标DNA。检测结果见图 1。
[0041]从图7中可以看出，随着目标DNA浓度的增加环介导等温扩增反应速度逐渐加快， 也就是说随着目标DNA浓度的增加，基于连接反应构建的双茎环结构DNA模板越多，可以检 测低至10am〇l/L的目标DNA，且不同浓度梯度之间可以相互区分，此结果表明本发明方法可 以用于定量检测DNA。同理本发明方法也可以用于其他DNA的定量检测。
【主权项】
1. 一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特征在于它由下述 步骤组成： (1) 根据待检测核酸序列，设计并合成具有茎环结构的探针A和探针B，其中探针A从5' 端到3'端依次为茎环区、检测识别区，探针B从5'端到3'端依次为检测识别区、茎环区且其 序列的5'端修饰磷酸基团，所述探针A和探针B的检测识别区是与待检测核酸互补的8~40 个喊基序列； (2) 将探针A、探针B的检测识别区与待检测核酸杂交，然后通过连接酶将探针A和探针B 连接起来形成双茎环结构DNA; (3) 以双茎环结构DNA为模板进行环介导等温扩增反应，并加入SYBR GreenI荧光染料， 实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线即可实现核酸的检测及定量分析。2. 根据权利要求1所述的基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特 征在于:所述的待检测核酸为RNA时，连接酶为T4RNA连接酶2、T4DNA连接酶、T3DNA连接酶中 的任意一种。3. 根据权利要求2所述的基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特 征在于:所述的探针A和探针B的检测识别区是与RNA互补的9~22个碱基序列。4. 根据权利要求1所述的基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特 征在于:所述的待检测核酸为DNA时，连接酶为AmpHgase^^A稳定型DNA连接酶、Taq DNA连 接酶、9°N? DNA连接酶中的任意一种。5. 根据权利要求4所述的基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特 征在于:所述的探针A和探针B的检测识别区是与DNA互补的15~25碱基序列。6. 根据权利要求1~5任意一项所述的基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸 的方法，其特征在于:所述的探针A和探针B的茎环区的茎的长度为5~18个配对的碱基序 列，茎环区的环的长度为15~35个碱基序列。
【文档编号】C12Q1/68GK105821138SQ201610316771
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】李正平, 王辉, 王洪红, 孙圆圆
【申请人】陕西师范大学