水稻抗白叶枯病基因xa25的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种水稻抗白叶枯病基因xa25的分子标记，以水稻作为物种，所述分子标记引物为：5’?TGGCTATGGCTAGTGAGAGGT?3’；5’?CTTTGTGGAGGGAAGGGAGA?3’。该分子标记能用于xa25基因的辅助选择育种。利用上述分子标记引物对待测水稻进行PCR扩增，所得PCR产物用限制性内切酶Mwo I进行酶切，当电泳条带有两条时，判定该待测水稻为含抗病基因xa25，当电泳条带只有一条时，判定该待测水稻为含感病基因Xa25。
【专利说明】
水稻抗白叶枯病基因 xa25的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一个种鉴定水稻抗白叶枯病基因xa25的分子标记及其育种应用，属于 作物遗传育种领域。
【背景技术】
[0002] 抗白叶枯病基因xa25来自于水稻优良恢复系"明恢63"，对白叶枯病菲律宾菌株 PX0339具有特异性的抗病性。最近，xa25基因被Liu等人(2011)克隆，表明抗病基因xa25与 感病品种"珍汕97"中的等位基因Xa25都编码0sSWEET13蛋白，但是两者的启动子区域存在 单核苷酸的多态性，导致Xa25基因受PX0339的诱导表达导致感病，而抗病基因xa25则不会 被诱导表达，则表现为抗病。因此，启动子序列的差异，导致基因的表达发生变化，是xa25基 因抗病的关键。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种白叶枯病抗性基因xa25辅助育种的分子标 记，其能用于xa25基因的辅助选择育种。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻抗白叶枯病基因xa25的分子标记， 以水稻作为物种，该分子标记引物为：
[0005] 5，-TGGCTATGGCTAGTGAGAGGT-3，；
[0006] 5 '-CTTTGTGGAGGGAAGGGAGA-3 '，
[0007]本发明还同时提供了上述水稻抗白叶枯病基因xa25的分子标记的用途：用于xa25 基因的辅助选择育种。
[0008] 即，当利用上述分子标记引物对待测水稻进行PCR扩增，所得PCR产物用限制性内 切酶Mwo I(NEB公司）进行酶切，当电泳条带有两条(大小约为247bp与103bp)时，判定该待 测水稻为含抗病基因xa25,当电泳条带只有一条(大小约为344bp)时，判定该待测水稻为含 感病基因Xa25。
[0009] 在发明过程中，为了在DNA水平可以区分，发明人比较了抗病基因xa25及其等位感 病基因Xa25的启动子序列，发现了两者序列中有1个-40(G/T)单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，导致了限制性内切酶Mwo I的识别位点发生了变化。因 此，在这个Mwo I酶的识别位点两侧设计了 1对PCR引物，进行PCR扩增，得到的PCR产物在用 Mwo頂每进行消化，再经电泳就可以区分这个SNP。利用这个分子标记能够很容易的鉴定水 稻品种中含xa25或Xa25基因。
【附图说明】
[0010] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0011]图1为xa25(明恢63)与Xa25(珍汕97)基因启动子序列比较。
[0012]小写字体的序列为xa25基因的5'UTR，大写字体序列xa25基因的转录起始位的上 游序列，下划线表示Mwo I酶识别位点，方框表示SNP (-40G/T)，箭头表示分子标记PCR上下 游引物的位置。
[0013]图2是已知含xa25或Xa25基因的不同水稻品种的分子标记分析。
[0014] M：DL2000marker；
[0015] 卜明恢63、2_中花11、3-日本晴含叉&25基因；
[0016] 4-珍汕 97、5-11?24、6-11^83、7-11^85、8-11^87、9-11^813、10-11^821含父325基因。 [00 17]图3是不同水稻地方品种的PX0339抗病性与xa25分子标记分析。
[0018] M: DL2000分子标记；1-桂花黄、2-白壳花螺、3-成农水晶米、4-立新粳、5-南雄早 油、6-齐头白谷、7-紫米;PX0339:白叶枯病菌小种;R:对PX0339抗病;S:对PX0339感。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0020] 实施例l、xa25与Xa25基因启动子SNP的酶切位点比较
[0021] 对xa25与Xa25基因启动子进行限制内切酶位点分析，发现xa25启动子中_40(G/T) 的SNP产生了1个Mwo I酶的识别位点，而Xa25启动子中相应的位置则没有Mwo I酶的识别位 点(图1)。
[0022]实施例2、水稻叶片基因组DNA的提取
[0023] 采用SDS法提取转基因水稻的基因组DNA:取水稻叶片0.1 g，用液氮研磨后，加600y 1 提取液（〇.lmol/L Tris-Cl pH8.0,500mmol/L NaCl，1.25g/L SDS)，65°C温育30min。加 200yl 5mol/L KAC，混匀后，冰浴30min。再加500yl氯仿，混匀，lOOOOr/min离心5min，取上 清，加2/3上清体积的异丙醇，混勾，1200〇1'/111；[11离心5111；[11。弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀， 倒置晾干，加l00yl TE溶解DNA。
[0024] 实施例3、xa25与Xa25基因启动子-40(G/T)SNP位点的PCR扩增
[0025] 在xa25与Xa25基因启动子-40 (G/T) SNP两侧设计1对PCR引物（图1) : 5 ' -TGGCTATGGCTAGTGAGAGGT-3 ' 与5 ' -CTTTGTGGAGGGAAGGGAGA-3 '，并在生物技术公司（如上海 Invitrogen)合成引物的DNA。
[0026] PCR扩增采用GoTa.q?Master Mix(Promega，USA)试剂盒，20yL体系，具体操作按照 产品说明书实施。扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸 30sec，35 个循环；72°C 延伸 5min。
[0027]实施例4、PCR产物的酶切与电泳分析
[0028] PCR产物用限制性内切酶Mwo I(NEB公司）进行酶切，方法见产品说明。然后，用1 X 丁八￡电泳液制备浓度为3%的琼脂糖凝胶，将2(^1?〇?产物与如110\1^&虹叫81^€打混 合，加到凝胶的点样孔中，在100V恒压下电泳30min。用溴化乙锭对凝胶进行染色，显示DNA 条带，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版）。在紫外透射仪上，用305nm 波段观察凝胶上的电泳条带。通过与DL2000marker比对，分析电泳条带的大小。
[0029]结果非常明显，含抗病基因xa25的水稻品种明恢63,其电泳条带有两条，大小约为 247bp与103bp，说明PCR产物被Mwo I酶切开;而含感病基因Xa25的水稻品种珍汕97,其电泳 条带只有一条，大小约为344bp，说明PCR产物未被Mwo頂每切开(图2)。
[0030] 备注说明：
[0031] 该247bp对应的序列为：
[0033] 该103bp对应的序列为：
[0035] 该344bp对应的序列为：
[0037] 为了证明本发明的正确性，发明人设置了如下验证试验：
[0038] 验证试验1
[0039] 按照实施例2的方法，提取多个不同水稻品种的基因组DNA。其中，中花11、日本晴 含抗病基因xa25(Liu et al，2011);国际水稻所的感病品种IR24及其的近等基因系（含其 它抗病基因）11?83、11^85、11^87、11^813、11^821，这些品种含感病基因乂325。再按照实施 例3与实施例4的方法，对这些水稻品种进行分析。结果与以上的一致（图2)，含抗病基因 xa25的中花11、3_日本晴，其电泳条带有两条，大小约为247bp与103bp;而含感病基因Xa25 的 IR24、IRBB3、IRBB5、IRBB7、IRBB13、IRBB21，其电泳条带只有一条，大小约为 344bp。
[0040] 验证试验2
[00411由于，xa25基因对白叶枯病菲律宾菌株PX0339具有特异性的抗病性。选取了7个水 稻地方品种:桂花黄、白壳花螺、成农水晶米、立新粳、南雄早油、齐头白谷、紫米，其中桂花 黄、成农水晶米、立新粳3个品种对PX0339具有抗病性，其余4个品种则对PX0339不抗病。按 照实施例2、实施例3与实施例4的方法，对这7个水稻品种进行分析，结果抗PX0339的品种， 其电泳条带有两条，大小约为247bp与103bp，为抗病基因xa25的带型;感PX0339的品种，其 电泳条带只有一条，大小约为344bp，为感抗病基因Xa25的带型。
[0042 ]对比例1、将实施例3中的分子标记引物改为：
[0043] 5，-TGGCTATGGCTAGTGAACCTA-3，与 5，-CTTTGTGGAGGGAAGTTCTC-3，。
[0044] 其余等同于实施例3和实施例4所述方法对验证实验1中的水稻品种进行检测。
[0045] 所得结果为：电泳无法得到以上所述的247bp与103bp条带，或344bp条带。
[0046]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 水稻抗白叶枯病基因 Xa25的分子标记，以水稻作为物种，其特征是所述分子标记引 物为： 5，-TGGCTATGGCTAGTGAGAGGT-3，； 5，-CTTTGTGGAGGGAAGGGAGA-3，。2. 如权利要求1所述的水稻抗白叶枯病基因 xa25的分子标记的用途，其特征是：用于 xa25基因的辅助选择育种。3. 根据权利要求2所述的水稻抗白叶枯病基因 xa25的分子标记的用途，其特征是： 利用分子标记引物对待测水稻进行PCR扩增，所得PCR产物用限制性内切酶Mwo I进行 酶切，当电泳条带有两条时，判定该待测水稻为含抗病基因 xa25,当电泳条带只有一条时， 判定该待测水稻为含感病基因 Xa25。
【文档编号】C12Q1/68GK105821148SQ201610373907
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】陈析丰, 李明星, 张怡婷, 马伯军
【申请人】浙江师范大学