基因dgat1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因DGAT1在脂肪组织中的表达水平来检测猪肌肉中甘油三酯含量。该法具有快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的特点，适用于在猪养殖过程中动态监控猪肌肉中甘油三酯含量情况以便于随时掌握猪生长状况，对猪肌肉中脂肪的含量有一个相对精确的了解，进而对猪的日粮进行调整。
【专利说明】
基因DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法
技术领域
[0001]本发明属于猪肌肉中甘油三酯含量检测领域，尤其是涉及一种基因DGAT1检测猪 肌肉中甘油三酯含量的方法。
【背景技术】
[0002] 猪是我国主要的肉用动物，猪肉产量已占肉类总产量的60%以上。多年来的育种 工作使猪瘦肉率水平有很大提高、脂肪性状得以显著改良。然而，在瘦肉率上升的同时，猪 肉品质却在急剧下降。
[0003] 猪肌肉中脂肪通常称为肌内脂肪（DIF)，猪的肌内脂肪含量是其重要经济性状，也 是影响肉质的一个极其重要的指标，对肌肉的风味、嫩度和多汁性等食用品质有重要影响。 脂肪组织能大量储存甘油三酯，猪的肌内脂肪主要成分为甘油三酯，通过对甘油三酯的测 定可以了解猪肌肉中脂肪的积累情况。因此，可以通过肌肉中甘油三酯的含量来动态监控， 从而可以动态调节猪肉品质，进而对日粮进行调整，得到品质更好的猪肉。多年来，国内外 学者对猪肌内脂肪含量做了相当多的研究，其研究结果对猪品种的选育、肉品的加工利用 等均有重要的参考价值。
[0004] 二酰甘油酰基转移酶(Diacyl gycerol Acyl transferase，DGAT)是脂肪细胞中控 制三酰甘油合成的关键酶，在细胞脂肪代谢中起着重要的作用，其主要催化二酰甘油与脂 肪酸酰基生成三酰甘油。DGAT主要功能是催化DAG与酰基辅酶A结合生成TAG JAG是真核生 物能量贮存的主要形式，对细胞膜形式、脂蛋白运输有重要作用，在营养缺乏和应激时可提 供能量。TAG在体内过剩会导致糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等疾病。
[0005] 二酰甘油酰基转移酶是广泛存在于生物体内的一种细胞微粒体酶，它与脂肪代 谢、脂类在脂肪中的沉积、血衆中三酰甘油(Tiacylgycerol，TAG)的调节、肌肉中能量代谢 及畜禽卵母细胞的形成等有很大关系，并影响畜禽的产奶量和产蛋量。DGAT由酰基辅酶A (Acy 1 CoA)和二酰甘油(DAG)以共价键的形式结合，可以被二酰甘油特异激活，酰化作用刺 激蛋白可以增强其活性。编码二酰甘油酰基转移酶的基因分为DGAT1和DGAT2。
[0006] 二脂酰甘油酰基转移酶l(Acyl CoA:Diacylgycerol Acyltransferase，DGATl)是 哺乳动物体内的一种非常重要的酶，其主要机制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘 油。猪DGAT1基因定位于SSC4pl5,有17个外显子和16个内含子，5'UTR为lgSbpWUTR为 261bp，其cDNA全长为1935bp(Gen Bank收录号为AY093657)。猪DGAT1的cDNA基因序列与小 鼠、人和牛的cDNA具有83 %、88 %和91 %的同源性。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的 基因DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三 酯含量的方法，利用基因 DGAT1在脂肪组织中的表达水平来检测猪肌肉中甘油三酯含量。
[0009] 上述基因DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，通过定量PCR来检测基因 DGAT1在脂肪组织里mRNA的表达量，用于定量PCR基因DGAT1特异片段的引物对分别具有以 下碱基序列：
[0010] Forward primer：TGGAGATGCTGTTCCTCATCCAG,
[0011] Reverse primer：TGATGCGTGAGTAGTCCATGT〇
[0012]上述基因 dgati检须赌肌肉中甘油三酯含量的方法，包括以下步骤：
[0013] ⑴从被检测的猪组织中抽提总RNA，反转录得到相应的cDNA样品；
[0014] (2)用引物对Forward primer和Reverse primer对步骤（1)中的cDNA样品进行定 量 PCR〇
[0015]步骤（1)中的反转录反应体系和条件为:在20yl反转录体系中，加入4yl总RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C温育lOmin，再置于冰上急速冷却2min;然后加入：lyl dNTP Mix，0.5yl M-MLV，4yl Buffer，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC 1〇1^11，2〇1€2111111;最后-20°(：保存。
[0016] 步骤(2)中定量PCR扩增步骤的反应体系和反应条件为：
[0017] 反应体系：在20yl定量PCR反应体系中，含有lyl cDNA模板，10yl SYBR Premix Ex Ta定量II 2X，0.4iil R0X Reference Dyell 50X，l]iM的lyl引物Forward primer，liiM的 1 yl引物Reverse primer，6 ? 6yl无菌去离子水；
[0018] 反应条件：951€308;951€58,601€308,40个循环 ；95°(：158,60°(：1111111，951€308,60 °C15s〇
[0019] 针对目前猪养殖和生产中缺乏有效监测其肌内脂肪含量状况的措施，发明人研究 发现，DGAT1基因的表达量与猪肌肉中甘油三酯含量成正相关，而肌内脂肪含量的高低可由 猪肌肉中甘油三酯含量的情况体现出来，猪肌肉中甘油三酯含量又可以通过DGAT1基因的 表达量确定，因此，DGAT1在脂肪组织中的相对表达量可以用来反应猪肌内脂肪含量状况。 据此，发明人建立了一种基因DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因DGAT1在 脂肪组织中的表达水平来检测猪肌肉中甘油三酯含量。该法具有快速准确、操作方便且不 影响猪正常生长的特点，适用于在猪养殖过程中动态监控猪肌肉中甘油三酯含量情况以便 于随时掌握猪生长状况，对猪肌肉中脂肪的含量有一个相对精确的了解，进对猪的日粮进 行调整。
【附图说明】
[0020] 图1是5月龄、8月龄、11月龄猪肌肉甘油三酯的相对含量图。
[0021] 图2是5月龄、8月龄、11月龄猪脂肪组织中的DGAT1相对表达量及肌肉甘油三酯的 相对含量对照图，图中：左为DGAT1相对表达量图，右为DGAT1相对表达量与肌肉甘油三酯相 对含量的相关性图。
[0022]图3是5月龄、8月龄、11月龄猪脂肪组织中的IGF2相对表达量及肌肉甘油三酯的相 对含量对照图，图中：左为IGF2相对表达量图，右为IGF2相对表达量与肌肉甘油三酯相对含 量的相关性图。
[0023]图4是5月龄、8月龄、11月龄猪脂肪组织中的UCP3相对表达量及肌肉甘油三酯的相 对含量对照图，图中：左为UCP3相对表达量图，右为UCP3相对表达量与肌肉甘油三酯相对含 量的相关性图。
【具体实施方式】 [0024] 一、研究设计
[0025] 以巴马香猪为研究对象，正常喂食处理，在5月龄、8月龄、11月龄检测DGATUIGF2 和UCP3的表达水平，考察相关基因的表达量与猪肌肉甘油三酯含量的关系。
[0026] 利用NCBI数据库中公开发表的猪（sus scrofa)的DGAT1序列（序列登录号：GI: 927115121;参见网址:NCBI数据http://www.ncbi .nlm.nih. gov/)，IGF2序列(序列登录号： GI: 148747135)，UCP3序列（序列登录号:GI :47522913)，设计特异性定量引物，以便检测猪 的基因组中其相对表达量。猪(sus scrofa)的DGAT1特异片段，序列全长为1872bp;猪(sus scrofa)的IGF2特异片段，序列全长为1225bp;猪（sus scrofa)的UCP3特异片段，序列全长 为2245bp;猪的看家基因羟甲基胆素合成酶(HMBS)特异片段，序列全长为1434bp。
[0027] 用于定量PCR上述DGAT1特异片段的引物对，其碱基序列为：
[0028] Forward primer(Pl)：TGGAGATGCTGTTCCTCATCCAG；
[0029] Reverse primer(P2)：TGATGCGTGAGTAGTCCATGT〇
[0030]用于定量PCR上述IGF2特异片段的引物对，其碱基序列为：
[0031] Forward primer(P3)：GCATCGTTGAAGAGTGCTGC；
[0032] Reverse primer(P4):GAAATTGTCCGGAAGCACGG〇
[0033] 用于定量PCR上述UCP3特异片段的引物对，其碱基序列为：
[0034] Forward primer(P5)：GATCGGACCACTCCAGCATC；
[0035] Reverse primer(P6)：AATCGAACCTTCACCACGTCC〇
[0036] 用于定量PCR猪的看家基因羟甲基胆素合成酶(HMBS)特异片段的引物，其碱基序 列为：
[0037] Forward primer(P7)：GGAGTTCAAGAGTATTCGGGGA；
[0038] Reverse primer(P8):AGCATACATACACTCCTCAGGG〇 [0039] 二、研究方法
[0040] (1)动物和样品的获得
[0041]实验用猪在广西大学动物科学技术学院巴马香猪饲养基地喂养，不同月龄的猪分 栏饲养，每栏最多不超过4头，按体重的3%进行饲喂。在相应的时间点（5月龄、8月龄、11月 龄），空腹16小时后，称体重、手术采集猪背部皮下脂肪，将采集的猪背部皮下脂肪样品立即 用液氮冷冻，然后放置于_80°C超低温冰箱冻存以待分析。采集猪背最长肌，生理盐水清洗 后用组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司）测定背最长肌甘 油三酯含量。
[0042] (2)总RNA提取和反转录
[0043] 从_80°C冰箱中取出O.lg的猪皮下脂肪组织样放入2ml离心管中，加入lml Trizol 试剂(ambion)，用高通量研磨仪(大连爱科仪器开发有限公司）研磨2min，后静置5min，让组 织充分裂解；向离心管中加入0.2ml的氯仿，用力摇晃30s，静置5min，后4°C 12000rpm离心 10min;取上清至另一 1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，后4 。(:12000rpm离心10min，弃上清;在离心管中加入70%的用DEPC水配制的乙醇，4°C12000rpm 离心3min，洗涤两次;沉淀自然挥发干，加入20y 1 DEPC水，-80°C保存。
[0044]通过酶标仪(TECAN infinite M200 PRO)测定总RNA浓度。
[0045] 在经过无RNA酶处理的PCR管(AXYGEN)中配制20yl反转录体系，进行反转录得到 cDNA样品。在20yl反转录体系中，加入4yl总RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C温 育lOmin，再置于冰上急速冷却2min;然后加入：lyl dNTP Mix(Solarbio dNTP Mix)，0.5yl M-MLV(TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV),4lil Buffer(TaKaRa 5XReverse Transcriptase M-MLV Buffer)，0.5yl RRI(TaKaRa)，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC 1〇1^11，2〇1€2111111;最后-20°(：保存。
[0046] (3)定量 PCR
[0047] 分别用基因DGAT1、IGF2和UCP3的特异性引物对(P1和P2、P3和P4、P5和P6)对步骤 (2)所述的cDNA样品进行定量PCR。用引物对P7和P8，对看家基因羟甲基胆素合成酶(HMBS) 进行定量PCR。对定量PCR的结果进行分析计算，得到其相对表达量。
[0048] 在8连管(AXYGEN)中配制20yl定量PCR体系，进行定量PCR。
[0049] 在20yl定量PCR反应体系中，含有lyl cDNA模板，10yl SYBR Premix Ex Ta定量II 2X(TaKaRaSYBR?Premix Ex Ta定量?II(Tli RNaseH Plus)试剂盒），0.4yl ROX Reference Dyell 50XUaKaRaSYBR》Premix Ex Ta定量?^KTli RNaseH Plus)试剂盒）， lyM的lul 引物Forward primer，luM的lul 引物Reverse primer，6 ? 6ul无菌去离子水；
[0050] 在定量PCR仪(Applied Biosystems 7500Real Time PCR System)中进行表达量 检测，反应条件：951€308;951€58,60 1€308,40个循环；95°(：158,60°(：1111111，951€308,60 1€ 15s〇
[0051] (4)统计分析
[0052] 结果用平均值土标准误差产方式表示。通过SPSS19.0软件(德国）用0ne-WayAN0VA 进行统计分析。P<〇.05可确定为具有统计差异。
[0053] 表1 5月龄、8月龄、11月龄猪的体重表格和背膘厚度
[0055] 三、研究结论
[0056] 表1和图1-4结果表明，基因DGAT1的表达量与肌肉甘油三酯正相关，而IGF2和UCP3 的表达量与肌肉甘油三酯相关性较差。因此，以基因DGAT1在猪脂肪组织中的mRNA相对表达 量可以用来反应猪的肌肉甘油三酯含量状况。
【主权项】
1. 一种基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于利用基因 DGAT1在脂 肪组织中的表达水平来检测猪肌肉中甘油三酯含量。2. 根据权利要求1所述的基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于通 过定量PCR来检测基因 DGAT1在脂肪组织里mRNA的表达量，用于定量PCR基因 DGAT1特异片段 的引物对分别具有以下喊基序列： Forward primer：TGGAGATGCTGTTCCTCATCCAG, Reverse primer：TGATGCGTGAGTAGTCCATGT〇3. 根据权利要求1所述的基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于包 括以下步骤： (1) 从被检测的猪组织中抽提总RNA，反转录得到相应的cDNA样品； (2) 用引物对Forward primer和Reverse primer对步骤（1)中的cDNA样品进行定量 PCR〇4. 根据权利要求1所述的基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 骤（1)中的反转录反应体系和条件为:在20μ1反转录体系中，加入4μ1总RNA，2μ1 Olig(dT)， 4μ1 DEPC水，先置于70°C温育lOmin，再置于冰上急速冷却2min;然后加入：1μ1 dNTP Mix， 0·5μ1 M-MLV，4yl Buffer，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC10min，2(rC 2min;最后_20°C保存。5. 根据权利要求1所述的基因 DGAT1检测猪肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 骤(2)中定量PCR扩增步骤的反应体系和反应条件为： 反应体系：在20μ1定量PCR反应体系中，含有ΙμL cDNA模板，10μ1 SYBR Premix Ex Ta 定量II 2Χ，0·4μ1 ROX Reference Dyell 50Χ，1μ1 的引物Forward primer，lyl的引物 Reverse primer，6.6yl无菌去离子水； 反应条件：951€308;951€58,60 1€308,40个循环；95°(：158,60°(：1111丨11，951€308,60 1€ 15s〇
【文档编号】C12Q1/68GK105821149SQ201610377191
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】周磊, 杨冉冉, 李星, 李一星, 靳艺
【申请人】广西大学