在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测及/或定量乙型肝炎病毒的引物、引物对及探针，该引物其序列编码为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4，上述引物可组成引物对，探针编码序列为SEQ ID No:5或SEQ ID No:6。本发明还提供了一种在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法。本发明提供的一种在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探针，其与乙型肝炎病毒具有高结合力，能够准确地判别样本中是否含有乙型肝炎病毒。本发明所述引物及/或探针能快速且准确地在体外检测样本中是否含有乙型肝炎病毒，并且通过分析检测结果获知该样本中乙型肝炎病毒的含量。
【专利说明】
在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的 引物、探针
技术领域
[0001] 本发明有关于一种在体外检测病毒的方法，特别指一种在体外检测或/及定量乙 型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探针。
【背景技术】
[0002] 虽然乙型肝炎疫苗在台湾以及许多国家已经全面施打，乙型肝炎（chronic hepatitis B)仍为全世界最常见的感染性疾病之一，据统计，全世界仍有三亿五千万人为 乙型肝炎慢性感染者，而其中超过75%在亚太地区，在台湾估计有接近四百万人感染慢性 乙型肝炎。感染乙型肝炎的患者，除了会导致急性肝炎、慢性肝炎等疾病外，同时较正常人 有较高机会罹患肝硬化（liver cirrhosis)或者肝癌（hepatocellular carcinoma)，而全 世界每年约有一亿人死于乙型肝炎相关疾病。以台湾来说，肝癌死亡率高居癌症相关死亡 率的第二位，2011年有8, 022人死于肝癌；而慢性肝病及肝硬化则为十大死因中的第八名， 2011年有5, 153人死于肝脏相关疾病；换言之，因肝癌与肝脏疾病死亡的总数，占了台湾所 有死亡原因的接近一成左右。
[0003] 乙型肝炎病毒属于Hepadnaviridae病毒属，为去氧核醣核酸病毒（DNA virus)， 具有3, 200个核苷酸，而乙型肝炎病毒至少有十种基因型（A-J型），各该基因型的序列间差 异大于8%。亚太地区最常见的乙型肝炎病毒基因型为基因型B及基因型C病毒，台湾又 以基因型B特别常见。基因型B的乙型肝炎病毒可再进一步细分为B1-B6六个亚型，其中， B2-B5等亚型在台湾较为常见。乙型肝炎病毒基因型有关于受其感染后转为慢性肝炎的机 会及罹患肝癌的机会有关，如被基因型A及基因型D的乙型肝炎病毒感染的患者具有较高 的机会转为慢性肝炎；而被基因型C或基因型D的慢性乙型肝炎患者有较高的机会罹患肝 硬化或者肝癌。依据台湾最近研究显示，相对于基因型B的慢性乙型肝炎携带者，带有基因 型C的慢性肝炎携带者有2. 35倍罹患肝癌的机会。
[0004] 除上所述乙型肝炎基因型可作为预测患者罹患肝癌或肝硬化的工具外，乙型肝炎 患者血液中的病毒DNA浓度可以作为预测慢性乙型肝炎患者将来罹患肝癌及肝硬化机会 的工具。具体来说，先前研究证实，不论乙型肝炎患者是否为HbeAg阳性、是否有肝硬化、肝 功能高低，乙型肝炎患者血中的DNA病毒量可用以单独预测该患者将来罹患肝癌的机会。 另有研究证实，罹患肝癌且接受手术治疗的患者，其血液中乙型肝炎DNA浓度与肝癌术后 复发机会相关。此外，部份慢性乙型肝炎患者血中的HbsAg虽然已经被清除，但是仍会被测 出血中含有乙型肝炎病毒DNA，因此，在将来使用化学治疗药剂（chemotherapy agents)或 者免疫抑制剂（immunosuppressive agents)进行治疗时，乙型肝炎在这些患者中出现再活 化的机会也较大，则仍应该定期追踪其血中乙型肝炎病毒DNA浓度，用以预测乙型肝炎病 毒是否再活化。
[0005] 由上可知，被乙型肝炎病毒感染的患者除应检测其乙型肝炎病毒基因型，并且 应定期追踪体内乙型肝炎病毒的有无及其浓度，才能对于肝脏相关疾病达到预防及治 疗的效果。目前临床上虽然建议慢性乙型肝炎患者每3-6个月要进行抽血及超声波检 查，以追踪是否有乙型肝炎的急性发作或者肝硬化、肝癌的发生。但是，目前抽血检查 的常规追踪项目中未将慢性乙型肝炎基因型及乙型肝炎病毒DNA在血中浓度列入，其 主要原因在于，目前临床上所使用的检测方法具有检测费用高昂、检测时间过长的缺失， 例如即时反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)需要至少两个以上引物及探针始能克服乙型 肝炎序列异质性，否则其准确性不高，并且要至少花费新台币1600元的检测费用。而 以全自动检测仪器（COBAS K Ampliprep real-time PCR system，RocheMolecular Systems, Branchburg, NJ)分析血液中病毒DNA定量费用约须新台币2000元，并且检测时间 须约2-4周才能完成。
[0006] 由此可知，目前现有的检测方法无法普遍地被应用于检测追踪慢性乙型肝炎感染 患者，达到预防或追踪相关肝脏疾病发生的功效。因此，开发出一种新颖的检测或/及定量 乙型肝炎病毒的方法为目前医学研究的重要课题。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的探针，其序列编码为SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6,其与乙型肝炎病毒具有高结合力，而能够准确地判别样本中是否含有 乙型肝炎病毒。一般来说，该探针得以人工合成方式或以设计好的专一性引物经聚合酶链 式反应制备而成。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种在体外定量及/或检测乙型肝炎病毒的方法，其 能够快速准确地获得检测结果，并通过与标准曲线的比对，得知待测样本中乙型肝炎病毒 的含量，且能够降低检测成本。
[0009] 本发明的第三个目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的引物，其对于乙型肝炎病 毒具有高度专一性，藉此得到放大待测样本中乙型肝炎病毒的片段，而能够判断待测样本 中是否含有乙型肝炎病毒以及其含量。
[0010] 为能达成上述目的，在本发明实施例中所揭一种用于检测及/或定量乙型肝炎病 毒的引物或引物对，其中，该引物的序列编码为SEQ ID N〇:l、SEQ ID N〇:2、SEQ ID N〇:3或 SEQ ID No:4,而该引物对由上述引物所组成，例如：该引物对具有编码SEQ ID No:l的正向 引物及编码为SEQ ID No:2的反向引物，或是编码SEQ ID No:3的正向引物及编码为SEQ ID No:4的反向引物。
[0011] 通过上述引物或引物对，本发明另一实施例揭露一种检测及/或定量乙型肝炎病 毒的方法，其将一待测样本的核酸分子与该引物或该引物对进行聚合酶扩增反应，分析该 反应结果，判断该待测样本中是否含有乙型肝炎病毒及其含量。
[0012] 较佳地，该步骤b中更包含提供一定量分子，举例来说，该定量分子为一荧光物质 或是一具电活性的DNA嵌合剂。
[0013] 而依据本发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识，分析聚合酶扩增反应的 方式众多，例如以胶体电泳进行DNA片段的分析、以光学仪器分析焚光分子的信号强度、以 电化学侦测分析DNA嵌合剂的信号等。
[0014] 本发明的实施例提供一种用于检测或/及定量乙型肝炎的探针，其序列编码为 SEQ ID No:5 或 SEQ ID No:6。
[0015] 本发明的又一实施例揭露在体外检测乙型肝炎病毒的方法，其包含下列步骤：
[0016] 步骤a :取一待测样本的核酸分子；
[0017] 步骤b :提供上述探针；
[0018] 步骤c :将该待测样本的核酸分子与该探针进行杂合反应；
[0019] 步骤d :分别测量该探针与该待测样本进行杂合反应前后的结合能力，据以分析 该待测样本中是否含有乙型肝炎病毒，其中，当该探针与该待测样本进行杂合反应后的结 合能力大于其进行杂合反应前的结合能力时，表示该待测样本含有乙型肝炎病毒。
[0020] 较佳地，该待测样本为血液、血清、血浆或体液。
[0021] 较佳地，该在体外检测乙型肝炎病毒的方法更包含一步骤e，设在该步骤d之后， 提供一含有不同浓度乙型肝炎病毒的标准样本，分别与该探针进行杂合反应，并测量各该 标准样本与该探针的结合能力，将乙型肝炎病毒浓度与其相对应的结合能力制备成为一标 准曲线，而将该待测样本的结合能力与该标准曲线相比较，得到该待测样本中乙型肝炎病 毒DNA的浓度。
[0022] 较佳地，步骤d中结合能力的测量标准为荧光强度、颜色变化、电阻变化或光学信 号，其中又以电阻变化的操作最为简便。
[0023] 本发明的有益效果为：
[0024] 本发明提供一种在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、 探针，其与乙型肝炎病毒具有高结合力，能够准确地判别样本中是否含有乙型肝炎病毒。据 此，本发明所述引物及/或探针能快速且准确地在体外检测样本中是否含有乙型肝炎病 毒，并且通过分析检测结果得以获知该样本中乙型肝炎病毒的含量。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明所述第一引物对、第二引物对及JX-1-1引物对于不同检体进行聚合 酶链式反应的分析结果。
[0026] 图2为检测第一检测试片与检体反应前后电阻值的结果。
[0027] 图3为检测第二检测试片与检体反应前后电阻值的结果。
[0028] 图4为检测第三检测试片与检体反应前后电阻值的结果。
[0029] 图5为检测第一检测试片与含有乙型肝炎病毒浓度为lng/ y L的检体反应前后电 阻值的结果。
[0030] 图6为检测第一检测试片与含有乙型肝炎病毒浓度为100pg/ y L的检体反应前后 电阻值的结果。
[0031] 图7为检测第一检测试片与含有乙型肝炎病毒浓度为lOpg/yL的检体反应前后 电阻值的结果。
【具体实施方式】
[0032] 除非另有定义，在本发明的说明书及申请专利范围所使用的技术及科学名词的意 义，其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本发明 内容为准。
[0033] 本发明所揭用于检测及/或定量乙型肝炎病毒引物能结合乙型肝炎病毒DNA的片 段，其序列编码为 SEQ ID No:l、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3 或 SEQ ID No:4。
[0034] 本发明所揭用于检测及/或定量乙型肝炎病毒引物对能结合并放大乙型肝炎病 毒的DNA片段，其中，该引物对的正向引物的序列编码为SEQ ID No: 1或SEQ ID No: 3,并 且，其反向引物的序列编码为SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。
[0035] 本发明所揭用于检测或/及定量乙型肝炎的探针，其序列编码为SEQ ID N〇:5及 SEQ ID No:6,具有与乙型肝炎病毒的DNA片段结合的功能。
[0036] 本发明所揭引物及引物对，通过比对不同型乙型肝炎病毒的全基因组序列设计而 得。
[0037] 本发明所揭探针，以序列编码为SEQ ID No: 1及SEQ ID No:2所组成的引物对或 序列编码为SEQ ID No:3及SEQ ID N〇:4所组成的引物对，通过聚合酶连锁反应自乙型肝 炎病毒DNA扩增出序列编码SEQ ID No:5或SEQ ID No:6的DNA片段。
[0038] 而本发明所揭引物、引物对或探针也得以人工合成方式所获得。所谓"人工合成 方式" 一词指通过人工方式将氨基酸依序连接而成为一多肽，包含化学合成法以及多肽合 成仪。一般来说，化学合成法可分为固相多肽合成法及液相多肽合成法，其中，液相多肽合 成法必须在完成每一氨基酸的连接后，进行萃取操作；固相多肽合成法先将所欲多肽的N 端氨基酸共价键结至聚合物颗粒上，其后再通过专一性键结的方式将后续氨基酸依序连接 上，最后合成该多肽。相较于液相多肽合成法，固相多肽合成法不需要纯化中间产物，具有 较佳产率，且可大幅缩短反应时间，在长链多肽的合成上也较具优势，因此，为目前较为广 为人所使用的多肽合成方法。
[0039] 如同本发明所属技术领域且具通常知识者所周知，由于本发明所设计的专一性引 物或引物对能与乙型肝炎病毒的核酸分子互补结合，因此，通过分析聚合酶链式反应的结 果，可检测出待测样本中是否含有乙型肝炎病毒及其含量。
[0040] 以下，为能更进一步说明本发明的多功效，将分别举实施例作详细说明，这些实施 例为用以解说的示例，其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求书的范围 及意义。
[0041 ] 实施例一：设计引物对
[0042] 根据国家生物资料中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI)的资料库，得知各类型乙型肝炎病毒全基因组序列。经由比对分析后，设计出一第一 引物对，包含编码为SEQ ID No. 1及SEQ ID No. 2的序列，以及一第二引物对，包含编码为 SEQ ID No. 3 及 SEQ ID No. 4 的序列。
[0043] 实施例二：制备探针
[0044] 分别以实施例一中所设计的该第一引物对及该第二引物对进行聚合酶链式反应， 35循环，自乙型肝炎病毒核酸分子中获特异性的DNA片段，并且，将各该片段以核酸定序 套组Terminator v3.lCycle Sequencing Kit)及自动化核酸遗传分析系统 (automated ABI PRISM⑩.3100，Biosystems，CA, USA)进行验证，得知各该片段的序列分 别为SEQ ID No. 5及SEQ ID No. 6,而将分别作为第一探针及第二探针，供后续实施例使用。
[0045] 实施例三：纯化乙型肝炎病毒
[0046] 取乙型肝炎血液样本，以离心机进行离心处理，收集各血液样本的白细胞层 (buffy coat) 1毫升，加入4毫升红细胞裂解液（RBC Lysis Buffer)，均勾混合，置于室温 下10分钟，再以转速3000rmp进行离心5分钟，去除其上清液后，加入1毫升的红细胞裂解 液，并且将沉淀物（pellet)打散，再次进行离心2分钟。去除上清液后，再将白细胞颗粒重 新悬浮于3毫升的红细胞裂解液中。在37°C下置放30分钟，加入6 y L的RNA酶A(10mg/ mL) (Amresco, OH, USA)，并在37°C下以150rmp的转速进行震荡30分钟。加入约1毫升的蛋 白质沉淀溶液（protein precipitation solution，RBC Bioscience)，进行震荡，再在室温 下以3000rmp进行离心5分钟，获得一上清液。将约3毫升的异丙酮加入该上清液中，均匀 混合，使DNA析出。以3000rmp进行离心5分钟后，完全去除上清液，取出DNA，再将1毫升、 浓度70%的乙醇与该DNA均匀混合，以3000rmp进行离心5分钟，去除其上清液，待乙醇挥 发，加入DNA水合液进行回溶，完成乙型肝炎血液样本的纯化。
[0047] 以全自动检测仪器（C_OBAS_' Ampliprep real-time PCR system， RocheMolecular Systems, Branchburg, NJ)测量该血液样本中乙型肝炎病毒DNA的浓度。
[0048] 实施例四：检测不同浓度的乙型肝炎病毒
[0049] 取编号1-4的检体，并且，经台北病理中心的检测数据可知，编号1至4的 检体中含有的乙型肝炎病毒浓度依序为5. 53X105copies/mL、2. 71X104copies/mL、 1. 21X107copies/mL、2. 61X106copies/mL。将各该检体分别以该第一引物对、该第二引物对 及JX-1-1引物对进行聚合酶链式反应，结果如图1所示。其中，JX-1-1引物对为文献中已 经发表使用于检测乙型肝炎的引物对，具有序列编码为SEQ ID No. 7的正向引物及序列编 码为SEQ ID No. 8的反向引物。而此所进行的聚合酶链式反应为本发明所属技术领域且具 通常知识者所周知，故实验流程在此不加以赘述。
[0050] 由图1的检测结果显示，本发明所揭第一引物对及该第二引物对分别能够有效地 区分出不同浓度乙型肝炎病毒的含量。
[0051] 实施例五：制备检测试片
[0052] 在本实施例中取该第一探针、该第二探针及Hxl-1探针分别制备成为第一检测试 片、第二检测试片及第三检测试片，其中，Hxl-1探针为先前文献中所公开用以侦测乙型肝 炎病毒的探针，其序列编码为SEQ ID No. 9。
[0053] 制备检测试片的流程如下：将各该探针分别以磷酸盐缓冲液稀释100倍，置放于 试管震荡器震荡均匀，再取40 yL滴于检测晶片表面，在常温下静置1小时，使各该探针键 结于各该检测晶片上。再将以磷酸盐缓冲液清洗各该晶片，用以去除未接附于晶片上的探 针，干燥各该晶片后，完成制备各该检测试片。
[0054] 实施例六：测试乙型肝炎病毒与探针的结合能力
[0055] 取一具有乙型肝炎病毒的检体，加入磷酸盐缓冲液稀释100倍，放置于95°C烧杯 隔水加热10分钟，并迅速放置于4°C冷藏90秒，降温至50°C后在试管震荡均匀。取该第一 检测试片、该第二检测试片及该第三检测试片，先分别测其电阻值，再将该检体溶液40 y L 分别加入该第一检测试片、该第二检测试片及该第三检测试片的表面，在50°C下静置30分 钟，再以磷酸盐缓冲液清洗后，进行电化学检测，结果如图2至图4所示。
[0056] 当所测得知电阻值越大，表示与检体中乙型肝炎病毒结合的探针数量较多，显示 探针的结合能力较强，相反地，当所测得知电阻值较小时，表示与检体中乙型肝炎病毒结合 的探针数量较少，探针的结合能力较差。并且，结合能力强的探针能侦测到较多病毒含量， 据以增加其检测的准确度，减少误判诊断的情形发生。
[0057] 依据上述说明，由图2至图4的结果可知，该第一检测试片及该第二检测试片确实 能够用以检测乙型肝炎病毒，并且，该第一检测试片及该第二检测试片被测得的电阻值明 显高于第三检测试片。由此结果可知，本发明所揭第一探针及第二探针分别较Hxl-1探针 具有较强的结合能力，因而能检测到较多的病毒含量，使包含该第一探针或该第二探针的 试片能具有良好的检测准确率。
[0058] 实施例七：检测探针的灵敏度
[0059] 取编号3的乙型肝炎检体，将其gDNA浓度制备为lng/yL、100pg/yL及10pg/ y L，分别以该第一检测试片进行检测，结果如图5至图7所示。由此结果可知，即使在乙型 肝炎检体中的病毒浓度为l〇pg/ y L时，该第一检测试片仍可以达到检测的目的。
[0060] 更进一步地以罗氏COBAS AmpliPrep全自动核酸萃取系统分析该第一检测试片能 检测的病毒量，发现该第一检测试片能检测到的病毒数量至少为2. 85X107copies/mL。将之 比对编号3的乙型肝炎检体在病理中心实际测得的病毒数量（1. 21X107C〇pieS/mL)，能更明 确地显示本发明所揭探针在样本中乙型肝炎病毒浓度为100pg/ y L时，仍具有检测效果。
[0061] 由上述结果可知，本发明所揭探针具有高灵敏度，因此，即使在样本含有少量的乙 型肝炎病毒时，本发明所揭探针仍具有良好的检出率，并且能够与较多的乙型肝炎病毒结 合。
[0062] 以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域者在不脱离本发明精 神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本发明权利要求所 涵盖。
【主权项】
1. 一种用于检测及/或定量乙型肝炎病毒的引物，其特征在于，用以结合样本中乙型 肝炎病毒的DNA，该引物选自由下列引物所组成的群：SEQ ID N〇:l所示序列、SEQ ID N〇:2 所示序列、SEQ ID No :3所示序列及SEQ ID No :4所示序列。2. -种用于检测及/或定量乙型肝炎病毒的引物对，其特征在于，用以结合样本中乙 型肝炎病毒的DNA，该引物对的正向引物选自由下列正向引物所组成的群：SEQ ID No: 1所 示正向引物及SEQ ID N〇:3所示正向引物；以及其反向引物选自由下列反向引物所组成的 群：SEQ ID No:2所示反向引物及SEQ ID No:4所示反向引物。3. -种检测及/或定量乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，包含下列步骤： (a) 取一待测样本的核酸分子； (b) 提供如权利要求1所述引物或如权利要求2所述引物对，与该待测样本中的乙型肝 炎病毒DNA片段进行扩增反应； (c) 分析该扩增反应的结果，据以得知该待测样本中是否具有乙型肝炎病毒及其含量。4. 如权利要求3所述检测及/或定量乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述步骤b中 更包含提供一定量分子，而选自由荧光物质及具电活性的物质所组成的群。5. -种用于检测或/及定量乙型肝炎的探针，其特征在于，序列选自由下列序列所组 成的群：SEQ ID No:5 及 SEQ ID No:6。6. -种在体外检测乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，包含有下列步骤： (a) 取一待测样本的核酸分子； (b) 提供如权利要求5所述探针； (c) 将该待测样本的核酸分子与该探针进行杂合反应； (d) 分别测量该探针与该待测样本进行杂合反应前后的结合能力，据以分析该待测样 本中是否含有乙型肝炎病毒，其中，当该探针与该待测样本进行杂合反应后的结合能力大 于其进行杂合反应前的结合能力时，表示该待测样本含有乙型肝炎病毒。7. 如权利要求6所述在体外检测乙型肝炎的方法，其特征在于，所述待测样本选自由 血液、血清、血浆及体液所组成的群。8. 如权利要求6所述在体外检测乙型肝炎的方法，其特征在于，更包含一步骤e，设在 所述步骤d之后，提供一含有不同浓度乙型肝炎病毒的标准样本，分别与该探针进行杂合 反应，并测量各该标准样本与该探针的结合能力，将乙型肝炎病毒浓度与其相对应的结合 能力制备成为一标准曲线，而将该待测样本的结合能力与该标准曲线相比较，得到该待测 样本中乙型肝炎病毒DNA的浓度。9. 如权利要求6所述在体外检测乙型肝炎的方法，其特征在于，步骤d中结合能力的测 量标准由选自由荧光强度、颜色变化、电阻变化及光学信号所组成的群。
【文档编号】C12R1/93GK105821156SQ201510003745
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】吴俊颖, 林肇堂, 赖紫纶
【申请人】台中荣民总医院, 辅仁大学学校财团法人辅仁大学