用于检测犬流感病毒的rt-lamp引物组合物、试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了用于检测犬流感病毒的RT?LAMP引物组合物、试剂盒及其应用。所述LAMP引物组合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP和SEQ ID NO.5所示的环引物LB组成。本发明所述的LAMP引物组合物在检测犬流感病毒中的应用。本发明筛选到用于检测犬流感病毒的LAMP引物组合物，建立了LAMP检测犬流感病毒的方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、快熟简便、无需特殊仪器等优点。
【专利说明】
用于检测犬流感病毒的RT-LAMP引物组合物、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测犬流感病毒的引物以及试剂盒，尤其涉及用于检测犬流感病 毒H3N2亚型的RT-LAMP引物组、以及检测犬流感病毒H3N2亚型RT-LAMP试剂盒。本发明属于 生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 流感病毒（Influenza virus)属于正粘病毒科流感病毒属，基因组是由8条负链 RNA节段组成，编码11或12个蛋白，病毒对包括禽类和哺乳动物等多种动物具有致病性，已 成为对人畜健康具有威胁力的重要传染病原。犬流行性感冒（Canine influenza，CI)是由 犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病，患 犬临床症状表现为体温升高、流鼻液、咳嗽、食欲减退、呼吸困难等，该病流行传播迅速，在 规模化养殖场常导致群体性流行并伴随死亡。研究证实，多种来源的流感病毒均可以自然 感染犬类，包括马源H3N8亚型、禽源H3N2亚型、禽源H5N1亚型、禽源H5N2亚型、禽H9N2亚型、 禽源H3N2重组的H3N1亚型病毒株、季节性H3N2亚型人流感和2009年甲型人流感等。虽然只 有马源H3N8亚型和禽源H3N2亚型能够在犬中水平传播并形成较稳定遗传谱系，但是鉴于A 型流感病毒具备较强的重组变异和跨种传播能力，犬类流感病毒的潜在的公共卫生问题一 直受到高度重视。另外，在我国工作犬领域中，H3N2亚型的犬流感病毒经常发生于各大繁殖 基地以及安全保卫活动现场，以呼吸道综合征为主要特征，并伴随其他病原感染，对工作犬 的嗅探作业形成巨大障碍，在社会公共安全领域该病也受到高度重视。
[0003] 犬流感病毒常规的诊断方法有:病毒分离、血凝/血凝抑制试验(HA/HI)、酶联免疫 吸附试验(ELISA)等，随着分子诊断技术的发展，RT-PCR以及荧光定量PCR等方法也应用到 CIV的检测工作当中。然而，上述几种方法或检测周期长、灵敏度不高、特异性不强，或需要 特殊的仪器设备，不适合基层养殖场和发病现场的快速检测。如今，随着宠物犬、军警犬对 该病快速诊断的需求的增加，迫切需要开发适合基层养殖场、发病现场乃至边境口岸的简 便、快速的检测方法及试剂盒。
[0004] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种 新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种引物，仅使用一种链置 换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件下作用40-60分钟，即可完成核酸扩增反应。 由于核酸扩增反应中会产生大量焦磷酸镁沉淀，因此可通过监测浊度来监控反应进程，同 时也可在进行核酸扩增反应时事先加入荧光目视检测试剂，即可在反应结束时在自然光或 者紫外线照射装置下通过目视进行结果判定，快速简便地鉴定靶基因的有无。因此，与其他 的检测技术相比，具有方便快捷、特异、敏感、稳定性强、不需要特殊设备、结果判断直观的 特点。与常规RT-PCR相比，RT-LAMP技术反应速度更快，在灵敏度、特异性和结果判定等方面 效果更优;与荧光定量RT-PCR相比，由于不依赖复杂的仪器设备，检测成本更低。
[0005] 本发明以我国犬流感H3N2亚型南京分离株为基础，以M基因为目标基因，设计RT-LAMP引物组，以此为技术核心，提供一种可专用于犬流感病毒H3N2亚型的RT-LAMP试剂盒和 应用方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测犬流感病毒的LAMP引物 组合物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种无需复杂设备、操作简便、敏感性高、易于判定结 果的检测犬流感病毒H3N2亚型的RT-LAMP试剂盒。
[0008] 本发明的又一目的在于提供上述LAMP引物组合物及试剂盒在检测犬流感病毒中 的应用。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0010] 用于检测犬流感病毒的LAMP引物组合物，其在于：所述LAMP引物组合物包括SEQ 10勵.1所示的正向外引物?3、3￡〇10勵.2所示的反向外引物83、3￡〇10勵.3所示的正向 内引物？1?、3￡〇10从).4所示的反向内引物81?和3￡〇10从).5所示的环引物1^。
[0011] 上述的LAMP引物组合物在检测犬流感病毒中的应用。
[0012] 上述的LAMP引物组合物在制备检测犬流感病毒的试剂盒中的应用。
[0013] -种检测犬流感病毒的试剂盒，其在于包含上述的LAMP引物组合物。
[0014] 上述的试剂盒，优选的包含反应缓冲混合液、反应引物混合液、反应酶类混合液；
[0015] 所述的反应缓冲混合液的组成为：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4， 50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine，2?8mmol/L dNTPs mixture；
[0016] 所述的反应引物混合液为上述的LAMP引物组合物中各引物组成的混合液，其中各 引物的浓度为：lwn〇l/L的正向外引物F3，lwnol/L的反向外引物B3,8wnol/L的正向内引物 FIP，8wnol/L的反向内引物BIP，4wnol/L的环引物LB;
[0017] 所述的反应酶类混合液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液。优选为:4U/ yL Bst DNA polymerise;5U/iiL AMV逆转录酶。
[0018] 上述的试剂盒，进一步优选的还包含荧光目视检测试剂。
[0019] -种检测犬流感病毒的方法，其在于提取待检样本RNA，以该RNA为模板，利用上述 的LAMP引物组合物进行LAMP扩增，扩增反应结束后观察结果，阳性反应呈绿色。
[0020] 所述LAMP扩增的反应体系包含所述的反应缓冲混合液12.5yL，所述的反应引物混 合液5yL，所述的反应酶类混合液2yL，模板溶液4yL，加去离子水适量至25yL。
[0021] 所述LAMP扩增的反应程序为:60°C~65°C，40min。
[0022]本发明的用于检测犬流感病毒的试剂盒采用以下步骤制备：
[0023] (1)从GenBank检索所有公开发布H3N2犬流感病毒的M、H基因序列，通过DNAstar软 件分析同源性。获得H3N2犬流感病毒M、H基因的特异性的保守序列；
[0024] (2)根据步骤(1)所得的保守靶DNA序列，设计得到三组RT-LAMP扩增引物。
[0025] (3)通过对步骤(2)中所述三组引物的扩增效果的比较，选定SEQ ID NO: 1~5所示 作为本发明中提及引物组合。
[0026] (4)配制LAMP反应液，结合所得的RT-LAMP引物，构成检测体系，进而组装成检测 H3N2犬流感病毒的RT-LAMP试剂盒。
[0027]本发明的用于检测H3N2犬流感病毒的RT-LAMP试剂盒，具体包含以下组分：
[0028] (1) 2 X LAMP 反应缓冲液：
[0029] 组分及浓度如下：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4,50mmol/L KC1， 16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine、2?8mmol/L dNTPs mixture。
[0030] (2)反应引物混合液：
[0031] 混合液中各引物的浓度分别为，lwnol/L的引物F3，lwnol/L的引物B3，8wn〇l/L的 引物BIP，8wnol/L 的引物FIP，4wnol/L 的引物LB。
[0032] (3)反应酶混合液：
[0033] 4U/liL Bst DNA polymerise;5U/liL AMV逆转录酶。
[0034] (4)荧光目视检测染料：
[0035] Loopamp?荧光目测试剂或|丐黄绿素/氯化猛染料溶液（625umol/L Calcein， 12.5mmol/L MnCl2)〇
[0036] (5)阳性模板:H3N2犬流感病毒南京分离株RNA。
[0037] 上述用于检测H3N2犬流感病毒的RT-LAMP试剂盒，检测H3N2犬流感病毒时按照以 下步骤进行：
[0038] (1)配制21yL LAMP反应基础体系，组分及用量如下：
[0039] 2 X LAMP反应缓冲液12.5yL;反应引物混合液5yL;反应酶类混合液2yL;荧光目视 检测染料1此;去离子水0.5此。
[0040] (2)按常规方法提取待测样品中的核酸，取4iiL核酸提取液加到上述已配制好的 LAMP反应基础体系中，使反应终体系为25yL;
[0041 ] (3)瞬时离心10s使反应体系充分混合，置63 °C恒温40min进行RT-LAMP扩增；
[0042] (4)80°C下5min进行酶灭活处理，终止反应。
[0043] (5)结果判定可采取两种方法：
[0044] (a)在自然光下观察，反应液如变成淡绿色说明待测样品中存在H3N2犬流感病毒， 如为橘色说明待测样品中不存在H3N2犬流感病毒。
[0045] (b)使用紫外照射装置，从反应管底部向上进行紫外线照射，佩戴护眼用具从侧面 进行观察，反应液发出绿色荧光说明待测样品中存在H3N2犬流感病毒，如未发出荧光说明 待测样品中不存在H3N2犬流感病毒。
[0046] 相较于现有技术，本发明具有下列突出的优点：
[0047] (1)高灵敏度:所需扩增模板仅需要0.04pg核酸（图1)。
[0048] (2)高特异性:对CDV及其他常见犬源性病毒、犬支气管败血波氏杆菌及其他常见 犬源性细菌均无扩增反应，只对H3N2犬流感病毒进行扩增(图2)。
[0049] (3)高稳定性:反应体系中预先加入荧光染料，扩增完成后无需打开反应管进行其 他操作，避免了反应产物形成的气溶胶对实验环境的污染，保证了多次扩增时的稳定性。
[0050] (4)操作简单：只需将反应体系放入63°C恒温水浴锅40min，就可完成扩增。
[0051] (5)易于判定结果:预先加入荧光染料，通过颜色变化即可进行判定。
[0052] (6)成本低:整个检测过程，无需昂贵仪器，降低了检测成本。
[0053]本发明的试剂盒及其应用方法可以在等温条件下，快速、高效、特异、灵敏地检测 H3N2亚型的犬流感病毒，不需要复杂仪器，降低了检测成本，能较好满足基层养殖场、宠物 诊所、出入境检疫、军警犬繁育部门等的现场检测需要，具有广阔的市场前景和较大的经 济、社会效益。
【附图说明】
[0054] 图1引物筛选结果柱状图
[0055] BlockA中1、2、4、7、8的下部呈红色，上部呈蓝色，3、5、6呈绿色；BlockB中，1呈绿 色，2的下部呈红色，上部呈蓝色。
[0056]图2引物筛选结果BLOCK A曲线图
[0057] 图3 CIV LAMP不同温度下扩增60分钟的扩增量
[0058] 其中，60°C、63°C、65°C对应的柱状图下部呈红色，上部呈蓝色，阴性对照的柱状图 呈绿色。
[0059] 图4 CIV LAMP病毒特异性试验结果图
[0060] 1对应的柱状图下部呈红色，上部呈蓝色，2-7对应的柱状图呈绿色。
[0061 ] 图5 CIV LAMP细菌特异性试验
[0062] 其中，1-Bb31124，2-巴氏杆菌，3-大肠杆菌，4-葡萄球菌，5-CIV培养物，6-CIV临床 样本
[0063]图6 CIV LAMP灵敏度试验浊度仪检测结果
[0064] 其中，1-6对应的柱状图下部呈红色，上部呈蓝色，7-8对应的柱状图呈绿色。
[0065] 图7 CIV灵敏度试验RT-PCR电泳结果图
[0066] 图8临床初步应用-自然光下的结果判定
[0067] 自然光下观察，1-CIV阳性培养物(呈绿色），2_临床阳性样本a(呈绿色），3_临床阴 性样本b(呈橘色），4_临床阴性样本c(呈橘色），5_阴性对照(呈橘色）
[0068] 图9临床初步应用-紫外光下的结果判定
[0069] 紫外光下观察，1-阴性对照(呈橘色），2_临床阴性样本c(呈橘色），3_临床阴性样 本b(呈橘色），4_临床阳性样本a(呈绿色），5_CIV阳性培养物(呈绿色）
【具体实施方式】
[0070] 实施例1犬流感病毒RT-LAMP引物筛选及反应体系优化
[0071] 1.提取核酸:按照常规方法提取待测样品的核酸。
[0072] 2.引物设计与筛选：根据Gen Bank公布的CIV M基因及H基因基因序列，通过 http: //primerexplorer ? jp/e/PrimerExplorer4 ? 0设计3组引物，包括内、外引物和环引 物。设计的三组引物将其编号为[1]、[2]、[3]，其中第[1]组引物为11基因引物，第[2]组和第
[3]组为M基因引物。利用3组引物对CIV RNA进行LAMP扩增，用LAMP Real Time Turbidimeter实时浊度仪LA-320C检测3组引物扩增效率，以筛选最优的一组引物，所筛选 的三组引物的序列见表1。
[0073] 表1第[1]、[2]、[3]组引物序列
[0075] 3 ?引物稀释：引物以ddH20稀释，内引物FIP/BIP使用浓度为40wn〇l/L，外引物F3/ B3使用浓度为5wiiol/L，环引物LB使用浓度为20wiiol/L。在25yL体系中每种引物加入lyL，使 各引物在反应体系中的终浓度如下：内引物FIP和BIP的终浓度为1.6wiiol/L，外引物F3和B3 的终浓度为0.2mi 〇1/L，环引物LB的终浓度为0.8mi〇1/L。
[0076] 4.RT-LAMP 反应：
[0077] 反应体系（21此预混液）：反应缓冲混合液12.5此，反应引物混合液(不添加环引物 时混合液为4yL，加环引物时引物混合液相应调整为5此或者6此），反应酶类混合液2yL (BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的等体积混合溶液），另加去离子水适量至21此。
[0078] 所述反应缓冲混合液组分及浓度如下：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4， 50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine、2?8mmol/L dNTPs mixture。
[0079] 所述反应酶类混合液:4U/liL Bst DNA polymerise;5U/liL AMV逆转录酶。
[0080] 向预混液中加入样本溶液4yL，使总量达25yL。对照反应中，阴性对照加入去离子 水4yL，阳性对照加入阳性对照RNA 4yL。
[0081 ] 反应温度63 °C 40min后在80 °C下5min终止反应。
[0082] 5?犬流感病毒LAMP反应产物的鉴定：利用LAMP Real Time Turbidimeter实时浊 度仪LA-320C实时监测LAMP反应情况，当线性图线性峰值超过预定标准(0.1)时，柱形底部 显示为红色，即反应判定阳性，蓝色柱状数值越高表示产物的量越多。曲线图表示反应速 率。
[0083]表2引物组合及验证条件
[0085] 柱状图1显示，除第[2]组不含环引物阳性组（引物组合编号5)未出现阳性反应外， 其他各阳性组均出现了蓝色柱状扩增条带（图1)。通过曲线图2,记录反应起始和结束时间， 第[1]组含环引物阳性组（引物组合编号1)在第20min左右开始扩增，第[3]组含环引物阳性 组（引物组合编号7)在第llmin开始扩增。综合扩增效率和检测时间的要求，优选第[3]组含 环引物（引物组合编号7)组成检测引物组合。其中各条引物序列如下：
[0087] 6.反应温度的优选：于LAMP Real Time Turbidimeter实时浊度仪LA-320C中，设 置温度分别为65°C、63°C和60°C，采用第[3]组引物组合进行温度梯度试验，观察反应温度 对扩增效率的影响。
[0088]结果显示，在三个温度梯度下均可进行高效的扩增，63°C的核酸扩增量最高（图 3 )，因此选择63 °C作为最佳反应温度。
[0089] 7 .检测时间的界定:根据多次检测中的RT-LAMP扩增曲线图，在20min内可以有效 完成整个扩增反应，以有效扩增时间的2倍作为临床检测时间。因此将检测时间界定为 40min〇
[0090] 8.优化后的反应体系及条件如下：
[0091] (1)以第[3]组含环引物组成检测引物组合，包含5条引物。
[0092] (2)优化后的反应体系：反应缓冲混合液12.5yL，反应引物混合液5yL，反应酶类混 合液2此，去离子水1.5此，新鲜提取的样本RNA 4此，总体系25此。
[0093]当需要进行荧光目视检测时，体系调整为:反应缓冲混合液12.5此，反应引物混合 液5yL，反应酶类混合液2yL，去离子水0.5yL(DW)，荧光目视检测染料1此，新鲜提取的样本 RNA 4yL，总体系25yL。荧光目视检测染料为钙黄绿素/氯化锰染料溶液（625mio1/L Calcein，12.5mmol/L MnCl2)〇
[0094] (3)置63 °C 恒温 40min进行 RT-LAMP扩增。
[0095] 实施例2犬流感病毒LAMP的特异性试验
[0096] 采用本研究设计筛选出的CIV LAMP引物，以背景明确的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV),犬副流感病毒（Canine Para-influenza Virus，CPIV)，犬腺状病 毒（Canine adenovirus，CAV)，H9亚型禽流感病毒，犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV)、 支气管鲍特杆菌ATCC 31124株、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌为待测样本，以CIV病毒 RNA为阳性对照，以双蒸水为阴性对照，按照所建立的CIV LAMP检测方法，检验该方法的特 异性。
[0097] 本实施例中的LAMP反应体系按照实施例1中优化后的反应体系和条件进行。
[0098] 结果所有测定样本中，以CIV病毒RNA样本呈阳性，其他样品均呈阴性，阴性对照成 立(图4、图5)。表明试验所用引物特异性良好。
[0099] 实施例3犬流感病毒LAMP的灵敏度试验
[0100] 首先利用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取的CIV的总RNA， 再利用eppendorf RS-232C检测RNA浓度，用双蒸馏水进行10倍梯度稀释，选取HT1到1(T7的 7个不同梯度为模板，并用蒸馏水作空白对照，按照所建立的CIV LAMP检测方法，进行灵敏 度试验。
[0101] 同时以相同的RNA样本，以M基因通用引物进行RT-PCR验证，并对产物做琼脂糖凝 胶电泳，将结果与LAMP试验结果进行比较。
[0102]检测所提取的RNA浓度为4.3mg/L，用双蒸水进行10倍梯度稀释，按照实施例1中优 化后的反应体系和条件进行扩增。用LAMP浊度仪实时检测60min，得到结果如图6，1至7分别 代表7个不同梯度，8为阴性对照。结果图显示7个梯度中1CT 1至1(T6梯度均能检测到有效扩 增，至1(T7梯度时不能进行有效扩增。以10倍梯度稀释后的RNA为样本，以M基因通用引物进 行RT-PCR验证，并对产物做琼脂糖凝胶电泳，结果显示最小检测限为1(T 4(图7)。
[0103] 与LAMP试验结果比较，LAMP的灵敏度比PCR灵敏度提高了100倍。
[0104] 实施例4临床样本的目视化鉴定
[0105] 收集临床疑似犬流感感染犬的鼻拭子3份，以血凝/血凝抑制方法对3份样本进行 初步筛查，并按照常规方法提取病毒RNA，按照实施例1中建立的目视化LAMP检测体系和条 件进行3份临床样本的RT-LAMP检测，设立阳性对照、阴性对照。在自然光、荧光照射装置下， 进行目视化的结果判定。比较血凝/血凝抑制方法和RT-LAMP的符合性。
[0106] 结果显示:扩增反应结束后在自然光或紫外线照射下观察产物的颜色变化。阳性 反应呈绿色，阴性反应呈橘色（图8、图9)，3份样本中样本a为阳性，样本b、c为阴性，检测结 果与血凝/血凝抑制方法结果相符。证明实施例1中建立的目视化LAMP检测体系和条件，能 够准确快速的检测鼻拭子样本中的流感病毒的有无。犬流感病毒H3N2RT-LAMP目视化检测 试剂盒的效果良好。
【主权项】
1. 用于检测犬流感病毒的LAMP引物组合物，其特征在于:所述LAMP引物组合物包括SEQ IDN0.1所示的正向外引物F3、SEQIDN0.2所示的反向外引物B3、SEQIDN0.3所示的正向 内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP和SEQ ID NO.5所示的环引物LB。2. 权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测犬流感病毒中的应用。3. 权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备检测犬流感病毒的试剂盒中的应用。4. 一种检测犬流感病毒的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。5. 根据权利要求4所述的检测犬流感病毒的试剂盒，其特征在于包含反应缓冲混合液、 反应引物混合液、反应酶类混合液； 所述的反应缓冲混合液的组成为：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4,50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0.2%Tween 20,1.6mol/L Betaine,2.8mmol/L dNTPs mixture； 所述的反应引物混合液为权利要求1所述的LAMP引物组合物中各引物组成的混合液， 其中各引物的浓度为：lymol/L的正向外引物F3，lymol/L的反向外引物B3,8ymol/L的正向 内引物FIP，8ymol/L的反向内引物BIP，4ymol/L的环引物LB; 所述的反应酶类混合液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液。6. 根据权利要求5所述的检测犬流感病毒的试剂盒，其特征在于还包含荧光目视检测 试剂。7. -种检测犬流感病毒的方法，其特征在于提取待检样本RNA，以该RNA为模板，利用权 利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增，扩增反应结束后观察结果，阳性反应呈绿 色。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述LAMP扩增的反应体系包含权利要求5中 所述的反应缓冲混合液12.5yL，权利要求5中所述的反应引物混合液5yL，权利要求5中所述 的反应酶类混合液2yL，模板溶液4yL，加去离子水适量至25yL。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于LAMP扩增反应程序为:60°C~65°C，40min。
【文档编号】C12Q1/70GK105821158SQ201610221926
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】秦海斌, 温海, 朱骞, 强京宁, 张汇东, 宋珍华, 刘永杰, 贺星亮, 高龙, 高一龙
【申请人】公安部南京警犬研究所