一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其制备方法。其文库包含羊口疮疫苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价，制备文库包括以下步骤：骆驼外周血淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化；CDSⅢ和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的方法将扩增产物与pGADT7共转染酵母细胞Y187；构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库；计算文库库容量；扩增cDNA文库进行质量评价。本发明针对羊口疮病毒构建的cDNA文库是一种具备病毒特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立羊口疮病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。
【专利说明】
一种抗羊口疮病毒双峰职VHH重链单域抗体cDNA文库及其制 备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体CDNA文库及其制备方 法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 0RFV能引起羊和人类的接触性感染，近年该病在我国广泛流行，对养羊业及人类 健康构成威胁。作为痘病毒科副痘病毒属的代表成员之一，0RFV拥有鲜明的种属特性和基 因功能的多样性，其基因组属于两端闭合的双股DNA，长约138kb，中央为核心区（88kb)，两 端为反向重复序列（Inverted terminal repeat，ITR)，冠以环状发夹结构。中央核心区基 因相对保守，主要调控病毒的复制、包装和输出。研究发现0RFV凭借自生稳定遗传的载体优 势携带着一些特殊的基因，通过各种表达产物协同的限制宿主的免疫清除效应，发展和进 化了一整套的免疫调节策略，确立了病毒得以顺利复制和设计免疫逃逸。由此可见，0RFV与 宿主互作时，病毒的相关功能基因各尽其责，最终使病毒得以顺利复制和免疫逃逸。因此， 要建立0RFV早期快速诊断技术，明确0RFV的致病机理，需从病毒功能性抗体入手，通过病毒 新型纳米VHH抗体文库来筛选病毒功能抗体是解决该问题的关键，构建VHH cDNA文库是解 决该问题的基础。
[0003] 纳米抗体从发现至今，已经发展为有广泛生物应用价值和临床应用价值的高度通 用分子。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳 定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于 抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有 重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳 定性，具有常规单域抗体无法比拟的水溶性和构象稳定性。这种单体结构域能高特异性、高 亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。凭借以上特性单域抗体与普 通抗体相比有很大优势。单域抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最 小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低 等特点成为当前分子影像研究中的重要靶分子，这为工程化抗体提供了一个良好的来源， 具有广阔的应用前景。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很高的价值。
[0004] 因此，综合目前在抗体领域的研究和利用情况，不难发现传统抗体类药物仍面临 着挑战，有必要设计和生产新一代更有效的抗体分子以满足临床的需要。特别是如何实现 抗体小型化，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者 其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。
[0005] 文库的容量和多样性很大程度上影响从中淘选出特异性抗体的概率以及抗体的 亲和力。自1976年构建的第一个cDNA文库以来，其方法不断的改进，其中SMART( Switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)方法构建的cDNA文库能够代表原有样品中 mRNA的丰度，保存了生物遗传信息的完整性。而且该方法只需要25ng的mRNA或者50ng的 Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品 中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库。同时酵母双杂交技术能够从构 建的宿主细胞cDNA文库中筛选出与已知目的蛋白相互作用的蛋白。本发明成功构建了酵母 双杂交cDNA文库，该文库的库容为6.1 X 106cfu/ml，文库重组率为100 %，可为羊口疮及其 他羊病毒病基因功能及致病机理奠定基础。
【发明内容】
[0006] 鉴于此，本发明涉及一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库及其 制备方法，因VHH纳米抗体具有相对分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发 酵生产和进行基因工程改进的优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展 前景。本发明针对羊口疮病毒构建的VHH cDNA文库是一种具备型特异性、生物学活性好、结 合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立 羊口疮病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的作用。
[0007] 本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0008] 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其包含羊口疮疫苗免疫 骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价。
[0009] -种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，双峰驼免疫程序和抗原接 种剂量为，首免15头份、二免30头份、三免30头份，所述免疫程序为首免后第21天进行二免、 第35天进行三免，首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用0RFV抗体ELISA检测试剂盒检测 血清抗体效价，抗体达到实验要求后，静脉采血。
[0010] -种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，其包括以下步 骤：
[0011] (1)骆驼淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化；
[0012] ⑵CDSm和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的 方法将扩增产物与PGADT7共转染酵母细胞Y187;
[0013] ⑶构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库；
[0014] (4)计算文库库容量；
[0015] (5)扩增cDNA文库进行质量评价。
[0016] 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤（1)骆驼 淋巴细胞分离步骤如下，颈静脉采集骆驼抗凝血l〇〇ml，等量加入全血稀释液，混匀，以5:9 的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18-22 °C，20min，小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机 lOOOrpm，18-22°C，lOmin,弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机lOOOrpm，18-22 °C，10min离心;弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮 于RNAlater中，置-70°C保存备用。
[0017] 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤（1)总 RNA提取步骤为吸取上述淋巴细胞液400ul，加入lmlTRizol，混匀，4°C静置5min，加入200ul 三氯甲烷，混匀，室温静置31^11，1200(^/111111，4°(：，离心15111111，吸取75〇111上清，加等量异丙 醇，室温静置lOmin，10000r/min，4°C，离心1 Omin，轻弃上清，沉淀加75%乙醇，8000r/min，4 °C，离心5min，沉淀置通风橱lOmin使之干燥，20ul无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总 RNA〇
[0018] 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，所述步骤(2) 中两套扩增引物为，第一轮扩增引物：
[0021]第二轮扩增引物：
[0024] 一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤(3)中构建 骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因cDNA文库的步骤为采用PEG/LiAc法制备酵母Y187感受态细 胞，每600uL感受态细胞转化20ul双链cDNA和6ul pGADT7-Rec，将转化的菌液均匀涂布于直 径100mm的和150mm的SD/-Leu平板上，30°C倒置培养3-5d直至克隆出现，再次将平板置于4 °C冰箱，放置3-4h，给每块平板加入5mL冻存液(25 %甘油的YPDA液体培养基），并加入无菌 玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液。
[0025] 一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备方法，步骤(5)中扩增 cDNA文库进行质量评价为取共转化产物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀释，分别涂100ul稀 释液至100mm SD/-Leu平板，30°C倒置培养3-5d直至克隆出现，此时对生长的单菌落计数， 并计算文库容量，随机挑取16个单菌落，用pGADT-Rec通用测序引物进行菌落PCR，分析文库 插入片段的大小以及重组率，PCR反应参数：94°C预变性5min;94°C变性lmin，56°C退火 11^11，72°(：延伸2111111，共30个循环，最后72°(：延伸1〇111111。取7111?0?产物进行1.2%琼脂糖凝 胶电泳分析。
[0026]本发明的优点是:本发明提供的cDNA文库理论上包涵羊口疮病毒蛋白的全部VHH 抗体信息，为之后筛选针对羊口疮病毒的全部VHH基因提供研究材料，因VHH纳米抗体具有 相对分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等 优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展前景，本发明针对羊口疮病毒 构建的cDNA文库是一种具备型特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能 的抗体文库，尤其是单域抗体之类的新型抗体，对于建立羊口疮病毒的临床诊断方法，研究 病毒的感染机理等具有极其重要的作用。
【附图说明】
[0027]下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
[0028] 其中图1为骆驼外周血淋巴细胞总RNA电泳图；
[0029]图2为骆驼外周血淋巴细胞ds cDNA第一轮扩增琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]图3为骆驼外周血淋巴细胞ds cDNA第二轮扩增琼脂糖凝胶电泳图；
[0031]图4为骆驼外周血淋巴细胞酵母双杂交cDNA文库单克隆PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0032]以下将结合附图对本发明进行详细说明。
[0033] 1.1.1试验动物、抗原、佐剂和羊口疮病毒抗体检测试剂盒
[0034] 1峰雄性双峰驼（1周岁），1峰雌性双峰驼(6个月大）；0RFV抗体ELISA检测试剂盒购 自美国BIOPORTC公司。
[0035] 1.1.2菌株和试剂
[0036]酵母文库相关载体购自Clontech，限制性内切酶购自NEB、淋巴细胞分离液 (1.077)购自上海生工、Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为 OMEGA产品、PCR相关试剂购自宝生物公司、分子生物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂 均为国产分析纯。
[0037] 1.2 方法
[0038] 1.2.1抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体效价的测定
[0039]在双峰驼的颈部皮下、背部皮下和后腿皮下进行分点接种，每个部位不少3个接种 点。首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用0RFV抗体ELISA检测试剂盒检测血清抗体效 价，抗体达到实验要求后，静脉采血。具体动物免疫程序和抗原接种剂量如下：
[0041 ] 1.2.2淋巴细胞分离
[0042]测定抗体效价达到要求后，颈静脉采集骆驼抗凝血100ml，等量加入全血稀释液， 混匀；以5 : 9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机 1800rpm，18-22°C，20min;小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之， 水平离心机lOOOrpm，18-22°C，10min ;弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机 1000rpm，18-22°C，10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并 且计数后并悬浮于RNAlater中，置-70°C保存备用。
[0043] 1 ? 2 ? 3淋巴细胞总RNA的提取和RT-PCR
[0044] 吸取上述淋巴细胞液400ul，加入lmlTRizol，混匀，4°C静置5min;加入200ul三氯 甲烷，混匀，室温静置3min，12000r/min，4°C，离心15min;吸取750ul上清，加等量异丙醇，室 温静置1〇111；[11，100001'/111；[11，4°0，离心10111；[11;轻弃上清，沉淀加75%乙醇，80001'/111；[11，4°0，离 心5min;沉淀置通风橱10min使之干燥；20ul无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总RNA， ND2000测得Total RNA浓度为4029ng/ul，纯度0D260/0D280为1.92。其电泳检测见图1
[0045] 1.2.4文库制备引物的设计
[0046] 第一轮扩增引物：
[0047] F1:5-GTCCTGGCTGCTTCTACAAGG-3
[0048] Rl：5-GGTACGTGGTTGAACTGTTCC-3
[0049] 第二轮扩增引物：
[0050] F2:5-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAAGTGGGAGTCTGGGGGAGG-3
[0051 ] R2:5-GTATCGATGCCCACCCTCTAGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT-3
[0052] 1.2.5 cDNA合成双链及纯化
[0053] 1.2.5.1全基因〇0嫩合成
[0054] 在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：
[0056] 混匀，将离心管放置于72°C金属浴，孵育2min，立即置冰上，冷却2min，依次加入下 列组分：
[0058]混匀，将离心管放置于42°C金属浴，反转录lh，室温冷却，加入lyl RNA酶抑制剂 (2u/ul)，得到的产物为全基因组cDNA，置-20°C保存备用。
[0059] 1.2.5.2第一轮扩增
[0060] 在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：
[0063]上述扩增程序:95°(：1111111;95°(：158,681€5111111，20个循环 ；681€5111111。将扩增产物电 泳，纯化收集600bp产物，-20°C保存备用。
[0064] 1.2.5.3第二轮扩增
[0065] 在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：
[0067]上述扩增程序：95°(：1111111;95°(：158,681€5111111，20个循环 ；681€5111111。扩增产物电 泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集400bp产物，置-20°C保存备用。
[0068] 1.2.7文库的构建和收获
[0069] 采用TOG/LiAc法制备酵母Y187感受态细胞。每600uL感受态细胞转化20ul双链 cDNA和6ul pGADT7-Rec，将转化的菌液均匀涂布于直径100mm的和150mm的SD/-Leu平板上， 30°C倒置培养3-5d直至克隆出现。再次将平板置于4°C冰箱，放置3-4h。给每块平板加入5mL 冻存液(25 %甘油的YPDA液体培养基），并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌 液。
[0070] 1.2.8文库的质量评价
[0071] 取共转化产物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀释，分别涂100ul稀释液至100mm SD/-Leu平板，30 °C倒置培养3-5d直至克隆出现，此时对生长的单菌落计数，并计算文库容 量。随机挑取16个单菌落，用pGADT-Rec通用测序引物进行菌落PCR，分析文库插入片段的大 小以及重组率。PCR反应参数：94°C预变性5min;94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸 2min，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。取7ul PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。 [0072] 2 ?结果
[0073] 2.1骆驼外周血淋巴细胞总RNA的提取及mRNA的分离纯化
[0074] 提取的总RNA经紫外分光光度计测定，浓度为4029ng/ul，0D260/0D280为1.92。变 性琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S、5S 3条清晰带，28S: 18S约为2:1。说明RNA和mRNA纯度较 高，满足文库构建的需要，如图1所示。M.DL5000相对分子质量标准；1.骆驼外周血淋巴细胞 总 RNA〇
[0075] 2.2双链cDNA文库的琼脂糖凝胶电泳
[0076] 取第一轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集600bp条带。取第二轮扩增的ds cDNA 产物进行电泳，收集400bp条带。如图2、图3所示。M. DL2000相对分子质量标准；1，2.第一轮 扩增(18 0嫩，60(^口，]\〇12000相对分子质量标准；1，2.第二轮扩增(18 0嫩，40(^口
[0077] 2.3文库容量及多态性鉴定
[0078]对涂布不同稀释度文库的平板进行单菌落计数，根据公式:文库滴度=平板上菌 落数/平铺菌液体积(ml) X稀释因子，经计算pGADT7-Rec文库滴度约为6.1 X 106cfu/ml。从 SD/-Leu平板上随机挑取15个克隆进行菌落PCR，电泳结果显示文库插入片段为400-2000bp，平均插入片段约为lOOObp。由菌落PCR结果可以得知文库的重组率为100%。如图4 所示。M. DL5000相对分子质量标准;1-15:酵母菌落的PCR结果。
[0079]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其特征在于:包含羊口疮疫 苗免疫骆驼的抗原剂量、免疫程序和血清抗体效价。2. 根据权利要求1所述的一种抗羊口疮病毒的双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库，其特 征在于:所述双峰驼免疫程序和抗原接种剂量为，首免15头份、二免30头份、三免30头份，所 述免疫程序为首免后第21天进行二免、第35天进行三免，首次免疫前和每次免疫后采集静 脉血，用ORFV抗体ELISA检测试剂盒检测血清抗体效价，抗体达到实验要求后，静脉采血。3. 根据权利要求1所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 骆驼淋巴细胞分离、总RNA提取及mRNA分离、纯化； (2) CDSm和SMART引物逆转录合成全长cDNA，设计两套扩增引物，采用同源重组的方法 将扩增产物与PGADT7共转染酵母细胞Π 87; (3) 构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因 cDNA文库； (4) 计算文库库容量； (5) 扩增cDNA文库进行质量评价。4. 根据权利要求3所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于：所述步骤（1)骆驼淋巴细胞分离步骤如下，颈静脉采集骆驼抗凝血 100ml，等量加入全血稀释液，混匀，以5:9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀 释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18-22°C，20min，小心收集淋巴细胞层于新的收集管， 以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机1000rpm，18-22°C，10min，弃上清，沉淀再用细胞洗 涤液稀释，水平离心机1000rpm，18-22°C，10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞， 取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮于RNAlater中，置-70°C保存备用。5. 根据权利要求3所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于：所述步骤（1)总RNA提取步骤为吸取上述淋巴细胞液400ul，加入 lmlTRizol，混匀，4°C静置5min，加入200ul三氯甲烷，混匀，室温静置3min，12000r/min，4 。(：，离心15min，吸取750ul上清，加等量异丙醇，室温静置lOmin，10000r/min，4°C，离心 lOmin，轻弃上清，沉淀加75%乙醇，8000r/min，4°C，离心5min，沉淀置通风橱lOmin使之干 燥，20ul无 RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总RNA。6. 根据权利要求3所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于:所述步骤⑵中两套扩增引物为，第一轮扩增引物： FI:5-GTCCTGGCTGCTTCTACAAGG-3 R1:5-GGTACGTGGTTGAACTGTTCC-3 第二轮扩增引物： F2:5-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAAGTGGGAGTCTGGGGGAGG-3 R2:5-GTATCGATGCCCACCCTCTAGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT-3 〇7. 根据权利要求3所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于:所述步骤(3)中构建骆驼抗羊口疮病毒的VHH基因 cDNA文库的步骤为采 用TOG/LiAc法制备酵母Y187感受态细胞，每600uL感受态细胞转化20ul双链cDNA和6ul pGADT7-Rec，将转化的菌液均匀涂布于直径100mm的和150mm的SD/-Leu平板上，30°C倒置培 养3-5d直至克隆出现，再次将平板置于4°C冰箱，放置3-4h，给每块平板加入5mL冻存液 (25%甘油的YPDA液体培养基），并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液。8.根据权利要求3所述的一种抗羊口疮病毒双峰驼VHH重链单域抗体cDNA文库的制备 方法，其特征在于:所述步骤(5)中扩增cDNA文库进行质量评价为取共转化产物菌液，按1/ 10、1/100和1/1000稀释，分别涂100111稀释液至10011111130/-1^11平板，30°(：倒置培养3-5(1直 至克隆出现，此时对生长的单菌落计数，并计算文库容量，随机挑取16个单菌落，用pGADT-Rec通用测序引物进行菌落PCR，分析文库插入片段的大小以及重组率，PCR反应参数:94°C 预变性5min;94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72°C延伸 lOmin。取7ul PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。
【文档编号】C40B50/06GK105821480SQ201610288469
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】 田宏, 吴锦艳, 林彤, 陈妍, 尚佑军, 郑海学, 张克山, 刘湘涛
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所