MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂及其制备方法和用图
【专利摘要】一种MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制剂，基于新型冠状病毒MERS?CoV主蛋白酶晶体结构而设计，本发明还提供了所述小分子抑制剂的合成方法，及其在制备用于治疗和预防MERS?CoV感染的药物中的用途。本发明的MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制剂能够显著抑制MERS冠状病毒主蛋白酶的活性，同时，对SARS、MHV等冠状病毒主蛋白酶也有较好抑制活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。
【专利说明】
MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明为生物制药的技术领域，具体说是一种MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂及 其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 冠状病毒（corona virus，Co V)为有膜单股正链RNA病毒，"Ni do viral es"目、 "Coronaviridae"科、"Coronavirinae"亚科，是目前所知最的大RNA病毒。根据血清学特性 和遗传学差异，冠状病毒亚科分为α、β、γ、δ4个属，β属再分为四个亚群(A-D)。自2012年9月 起，一种β属C亚群新型冠状病毒MERS_CoV(Middle East Respiratory Syndrome &31'〇1^￥；[1'118，中东呼吸综合征），对全球公共卫生安全造成了重大威胁。截止2015年5月25 日，据世界卫生组织(WHO)公布数据显示，全球累计实验室确诊的感染MERS-CoV病例共1139 例，其中431例死亡(病死率37.8%)。而且，这种病毒已经波及到中国，2015年5月，广州省惠 州市出现首例输入性中东呼吸综合征确认病例。因此针对新型冠状病毒特效药物的开发， 已迫在眉睫，这不仅是目前国际药物开发领域的研究热点，更是我国传染病防治工作的重 要组成部分。
[0003] 针对冠状病毒药物研发的路程是比较缓慢的。早在非典之前，人们就开始对冠状 病毒及其抑制剂进行研究，有实验室发现了 PMSF、TLCK和PefalocS等对人类冠状病毒229E 主蛋白酶的活性有很强的抑制作用，因其专一性差、毒副作用大而没有应用于治疗。非典期 间，科学家们试图利用如针对RNA聚合酶、S蛋白、N蛋白等病毒重要组分研发抑制剂来阻断 病毒的入侵、复制及转录，但开发新药风险大、临床试验用时长，至今仍无对应靶点的特效 药物。
[0004] 目前已对MERS-CoV的同族病毒SARS的转录、复制及增殖的过程有了相当深入的了 解。冠状病毒作为单股正链病毒，编码约16个非结构蛋白介导自身的转录复制过程。这其 中，nsp5(即主蛋白酶)参与将冠状病毒基因组编码的复制酶多蛋白酶切水解为病毒基因组 复制所必需的16个非结构蛋白的过程，因而在冠状病毒的转录复制中发挥了至关重要作 用。并且在人体内不存在nsp5的同源蛋白，因而nsp5蛋白是一个良好的抗冠状病毒革巴点。而 且，酶学实验进一步证实了冠状病毒主蛋白酶的底物结合位点是保守的。如果能够抑制 MERS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御MERS冠状病毒对人体的侵染。因 此，冠状病毒主蛋白酶是抗新型冠状病毒药物设计的理想靶标。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂及其制备方法和用途。
[0006] 本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂，结构通式为如下通式⑴所示：
[0007]
I、I. I ^ J
[0008]
[0009] X为NH、0或S中任一种；
[0010] 心选自如下基团构成的组心~以的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基
[0011] R2
选自如下基团构成的组:Ci~〇5的烷基或者环烷基、氣原子、苯基、苄基、对甲基 tJ· 苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基
|R3选自如下基团构成的组:&~C 5 的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、 * ? ·* ?
> - > · ， ，f J
[0012] R4选自如下基团构成的组:Ci~〇6的烷基或者环烷基、氣原子、苯基、苄基、对甲基 苯基、氟代苯基、氟代苄基；
[0013] Rg选自如下基团构成的组:Ci~〇5的烷基或者环烷基、氣原子、苯基、苄基、对甲基 苯基、氟代苯基、氟代苄基。
[0014] 进一步地，
[0015] 办优选选自如下基团构成的鉅 、，OH
[0016] 糾尤选甲基、轻甲基或Y ! ；
[0017] X 优选喊 NH;
[0018] R3优选异丙基、叔丁基、苄基、苯基、羟基、对氟苄基、 ? %，、、
[0019] R4优选环己基、异丙基、苯基、氢原子；
[0020]抱优选异丁基。
[0021 ]所述抑制剂优选自如下成员构成的组：
[0023]
[0024] 本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0025] A、将通式（II)对应化合物中的氨基保护基R6脱除，其中的R6选自如下基团构成的 组:叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0026] B、在缩合剂的存在下，将步骤A的产物与通式（III)对应化合物进行缩合，得到通 式⑴，
[0027]
[0028] 其中，通式（II)和通式（III)中的办、1?2、1?3、1]的定义都与通式（1)中的1? 1、1?2、1?3、1]定 义相同。
[0029] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法中，还包括如下步骤:在有机溶剂中， 使通式（II)对应化合物与酸或碱在室温下反应2~8小时，脱去氨基的保护基R6,抽去溶剂， 将得到的产物与通式（III)对应化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试剂和有机碱，在室 温下反应16~24小时，得到通式（I)对应化合物。
[0030] 所述的酸优选三氟乙酸或者盐酸；
[0031] 所述的碱优选氢氧化钠或甲醇钠；
[0032] 所述有机溶剂优选选自由如下成员构成的组:〇12(：12、1'册、01^、二氧六环 ；
[0033] 所述的非质子性溶剂优选自如下成员构成的组:〇12(：12、1'册、01^、二氧六环、二甲 亚砜、苯；
[0034] 所述的缩合剂优选自如下成员构成的组:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0035]所述的有机碱优选自由如下成员构成的组:LDA、三乙胺、DIEA。
[0036]本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂在制备用于治疗或者预防冠状病毒感 染的药物用途。
[0037] 所述冠状病毒为中东呼吸综合征冠状病毒、SARS冠状病毒或鼠肝炎病毒中任一 种。
[0038] 本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂能够显著抑制MERS冠状病毒主蛋白酶 的活性，同时，对SARS、MHV等冠状病毒主蛋白酶也有较好抑制活性，在制备用于治疗或者预 防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0039] 附图不一定是成比例的，其目的仅仅在于更好地解释本发明，以便于读者理解。
[0040] 图1为小分子N3对MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲线；
[0041 ] 图2为小分子Μ14对MERS-CoV Μ'的抑制活性曲线；
[0042] 图3为小分子M18对MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲线；
[0043] 图4为小分子Μ20对MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲线；
[0044] 图5、图6、图7分别是 Μ14的1H-NMR、13C-NMR、MS 图谱；
[0045] 图 8、图 9、图 10分别是Μ18 的1H-NMR、13C-NMR、MS 图谱；
[0046] 图 11、图 12、图 13分别是M20 的1H-NMR、13C-NMR、MS 图谱；
[0047] 附图中的MERS-CoV Μρ?°代表MERS冠状病毒主蛋白酶。
【具体实施方式】
[0048] 以下通过附图和具体实施例对本发明进行进一步详述：
[0049] 为了叙述上的方便，本文中使用了一些特定的术语，下面逐一对其进行解释。
[0050] "M14"、"M18"、"M20"是本发明特别优选的小分子抑制剂，其结构式分别为： LUU56J M20的结构式
[0057]化合物N3是已有报道的对SARS主蛋白酶有较好酶活性抑制作用的化合物，其结构 式为
[0058]
[0059] 本文中所使用的术语"MERS冠状病毒主要蛋白水解酶"、"MERS-CoV Μρκι"、"MERS冠 状病毒主蛋白酶"等，都是指MERS冠状病毒的主要蛋白水解酶。
[0060] 的烷基"是指碳原子数在1到6之间的直链、支链或环烷基，包括但是不限 于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、 正己基、异己基、环己基等。
[0061 ] "氟代苄基"包括对氟苄基、间氟苄基、邻氟苄基等。
[0062] 在部分结构式中，LDA代表二异丙基氨基锂，Et代表乙基，"Bn"代表苄基，"Boc"代 表叔丁氧羰基。
[0063] "TFA"代表三氟乙酸，"THF"代表四氢呋喃，"DMF"代表N，N-二甲基甲酰胺，"DMS0" 代表二甲基亚砜，
[0064] "Et3N"代表三乙胺，"DIEA"代表N，N-二异丙基乙胺，"EDCI"代表1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，"HATU"代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲 六氟磷酸酯，"HBTU"代表0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，"Η0ΒΤ"代表1-羟基苯并三 唑。
[0065] 本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂，结构通式为如下通式⑴所示：
.即 '>〇 ,
[0066] 1234 2 X为ΝΗ、0或S中任一种； 3 心选自如下基团构成的组:心~以的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基
4 办选自如下基团构成的组的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基 苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、
J1r3选自如下基团构成的组:(^~ C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、
[0071] R4选自如下基团构成的组:&~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基 苯基、氟代苯基、氟代苄基；
[0072]他选自如下基团构成的组:&~C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基 苯基、氟代苯基、氟代苄基。
[0073] 本发明的某些优选化合物符合下述通式，
[0074]
[0075] 进一步地，
[0076] Ri优选选自如下基团构成的组：
[0077] 吣优选甲基、羟甲基或
[0078] X 优选 0 或 NH;
[0079] R3优选异丙基、叔丁基、苄基、苯基、羟基、对氟苄基 v、
- .f、
[0080] R4优选环己基、异丙基、苯基、氢原子；
[0081 ] R5优选异丁基。
[0082]所述抑制剂优选自如下成员构成的组：
[0084]
[0085] 本发明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0086] A、将通式（II)对应化合物中的氨基保护基R6脱除，其中的R6选自如下基团构成的 组:叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0087] B、在缩合剂的存在下，将步骤A的产物与通式（III)对应化合物进行缩合，得到通 式⑴，
[0088]
[0089] 其中，通式（II)和通式（III)中的心办^的定义都与通式⑴中的心上^定 义相同。
[0090] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法中，还包括如下步骤:在有机溶剂中， 使通式（II)对应化合物与酸或碱在室温下反应2~8小时，脱去氨基的保护基R6,抽去溶剂， 将得到的产物与通式（III)对应化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试剂和有机碱，在室 温下反应16~24小时，得到通式（I)对应化合物。
[0091] 所述的酸优选三氟乙酸或者盐酸；
[0092] 所述的碱优选氢氧化钠或甲醇钠；
[0093] 所述有机溶剂优选选自由如下成员构成的组:〇12(：12、1'册、01^、二氧六环；
[0094] 所述的非质子性溶剂优选自如下成员构成的组:〇12(：12、1'册、01^、二氧六环、二甲 亚砜、苯；
[0095] 所述的缩合剂优选自如下成员构成的组:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0096]所述的有机碱优选自由如下成员构成的组:LDA、三乙胺、DIEA。
[0097] 通式（II)对应化合物的合成可参考文献：Qingping Tian，Naresh K.Nayyar, Srinivasan Babu,Lijian Chen,Junhua Tao, Steven Lee ,Anthony Tibbetts ,Terence Moran, Jason Liou,Ming Guo and Timothy P.Kennedy Tetrahedron Lett.2001,42, 6808-6809。通式（III)对应化合物合成可参考文献:Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou， Qiong Lei and Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004,45,8103_8105〇
[0098] 在本发明的一些优选实施例中，将通式（II)化合物在有机溶剂中与酸室温反应4 ~6小时;抽去溶剂，与通式（III)化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合剂，然后加入有机 碱，在室温下反应12~24小时得到通式（I)化合物。
[0099]其中，上面所述的酸优选为三氟乙酸或盐酸;优选的有机溶剂选自由下成员构成 的组:0^12、1'冊、1^二甲基甲酰胺、01^0、苯;优选的缩合试剂选自如下成员构成的组 ：撤1'1]、耶1'1]40(：1、0此4;优选的有机碱选自如下成员构成的组:二异丙基乙基胺、三乙胺。
[0100] 本发明挑选化合物M14、M18、M20合成来对本发明的合成方法及应用进行说明，但 不意味着限制本发明其余化合物的应用范围：
[0101] 为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给本发明的具体实施例。在对这些 实施例进行描述时，没有对公知的实验方法、仪器、试剂和材料等进行详细的描述，以避免 喧宾夺主。
[0102] 实施例1:
[0103] 将 300m
容解在 3mL
[0104] 干燥CH2C12中，加入0.49g碳酸氢钠，之后加入1.23g戴斯马丁试剂，室温下反应8~
12小时，用硫代硫酸钠溶液淬灭反应，饱和食盐水洗涤后旋干得： 。用干燥THF
? 5ml溶解后待用。将| 溶于5ml干燥THF中，-78°C冷却搅拌，之后加入60% NaH 0.078g搅拌lh，随即缓慢加入待用的
液，关闭制冷，反应12h，用饱和氯 化铵淬灭反应，旋干体系中的T H F，用E A萃取产物。快速硅胶柱层析，得到8 2 m g产物
将得到的产物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室温搅拌反应2小时， 抽干浴刑得到脱除Boc保护的产物，之后将其溶解在5ml的CH2C12中，加入158mg
[0105] 以及257uL DIEA，之后加入220mg HATU。体系于室温下反应12小时，依次用1M HC1、饱和NaHC03水溶液、饱和食盐水洗涤，之后收集有机相，无水Na2S〇4干燥，将Na 2S〇4过滤 出去，有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析，得到5 0 m g产物Μ 1 4
[0106] 产物氢谱以及质谱数据如下：
[0107] = 8.01-8.08(m，lH，NH)，7.86-7.95(m，lH，NH)，7.52-7.66(m，lH，NH)，6.77-6.88(m，lH，= CH)，6.54(d，J = 7.1Hz，lH，=CH)，5.75-5.89(m，lH，=CH)，4.89-4.98(m，lH，CH)，4.48- 4.57(m，2H，2CH),4.12-4.30(m，2H，2CH),3.01-3.18(m，2H，CH2)，2.46(s，3H，CH 3) ,2.10- 2.33(m，2H，CH2)，1.91-1.98(m，lH，CH)，1.78-1.90(m，lH，CH)，1.53-1.68(m，2H，CH2) ,1.40- 1.49(m,3H,CH2,CH),1.30(d J = 7.1Hz,3H,CH3) ,1.21(d J = 6.0Hz,6H,2CH3) ,0.91(d,J = 6.6Hz,3H,CH3),0.83(t J = 5.9Hz,9H,3CH3)〇
[0108] 13C-MlR(101MHz，DMS0-d6):Sl78.77(s)，172.11(s),172.03(s)，171.74(s)， 171.04(s),165.53(s),159.06(s),158.66(s),149.61(s),120.48(s),101.78(s),67.71 (s),57.87(s),51.86(s),49.12(s),47.73(s),41.19(s),38.00(s),35.45(s),31.25(s), 30.89(s),29.47(s),27.81(s),24.72(s),23.16(s),22.29(s),22.08(s),19.53(s),18.53 (s),18.44(s),12.29(s)〇
[0109] ESI-MS calcd for[C3iH48N608,M+H]+:633.35,Found:633.49〇
[0110] 实施例2:
[0111] 将
i 于 3ml CH2CI2 中，加入 220μ1 DIEA 和 140mg
常温搅拌12h，硅胶柱层析得到1
[0112] 将得到的产物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室温搅拌反应2小时，抽干溶剂得到 脱除Boc保护的产物，之后将其溶解在3ml的CH2C12中，加入192m:
[0113] 以及320ul DIEA，之后加入380mg HATU。体系于室温下反应12小时，依次用1M HC1、饱和NaHC03水溶液、饱和食盐水洗涤，之后收集有机相，无水Na2S〇4干燥，将Na 2S〇4过滤 出去，有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析，得到80mg产物Ml
[0114] 产物氢谱以及质谱数据如下：
[0115] 4 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.59((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 18-8 ·28(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 7.98-8.09(m，lH，NH)，7.89-7.97(m，lH，NH)，7.57(s，lH，NH)，7.13-7.46(m，4H，-Ph)，6.82- 6.93(m，1H，=CH)，6· 55(s，1H，=CH)，5.83-5.92(m，2H，=CH，CH) ,4.42-4.64(m，2H，2CH)， 4.14-4.31(m,2H,2CH),2.98-3.20(m,2H,CH2),2.47(s,3H,CH 3) ,2.22-2.36(m,lH,CH), 2.04-2.20(m,1H,CH),1.76-2.00(m,2H,CH2),1.60-1.71(m,lH,CH),1.39-1.58(m,7H, 2CH2,CH3),1.24-1.35(d,3H,CH3),0.88-0.94(m,3H,CH 3),0.78-0.85(m,9H,3CH3)〇
[0116] 13C NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172,02(s),171.74(s),171,04(s), 165.21(s),159.07(s),158.65(s),151.93(s),139.64(s),128.51((1,C-F),125.37(s), 120.04(s),115.78(2),115.57(2),101.78(s),71.60(s),57.86(s),51.88(s),49.12(s), 47.76(s),41.18(s),38.00(s),34.84(s),31.27(s),30.89(s),29.48(s),24.73(s),23.08 (s)，22.55(s)，21.49(s)，19.52(s)，18.54(s)，14.41(s)，12.29(s)。
[0117] ESI-MS calcd for[C36H49FN608，M+H]+:713.36，Found:713.43 〇
[0118] 实施例3
[0119] 來
§于3mlCH2Cl2中，加入220yLDIEA和 140mg
常 温搅拌12h，硅胶柱层析得到98n
[0120] 将得到的产物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室温搅拌反应2小时，抽干溶剂得 到脱除Boc保护的产物，之后将其溶解在5ml的CH2C12中，加入192mg
[0121] 以及320yL DffiA，之后加入380mg HATU。体系于室温下反应12小时，依次用1M HC1、 饱和NaHC03水溶液、饱和食盐水洗涤，之后收集有机相，无水Na2S04干燥，将Na 2S04过滤出去， 有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析，得到82mg产物M2I
[0122] 产物氢谱以及质谱数据如下：
[0123] 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.58((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 17-8 ·32(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 8.06(d，J = 7.6Hz，lH，NH)，7.93(d，J = 8.8Hz，lH，NH)，7.58(s，lH，NH)，7.26-7.39(m，5H，- Ph),6.82-6.96(m,lH,=CH),6.55(s,lH,=CH),5.90(d ,J=15.7Hz,lH,=CH),5.61-5.70 (m,lH,CH),4.47-4.60(m,2H,2CH),4.17-4.32(m,2H,2CH),2.96-3.19(m,2H,CH2),2.47(s, 3H,CH3),2.26-2.34(m,lH,CH),2.05-2.14(m,lH,CH),1.77-1.98(m,4H,2CH 2) ,1.53-1.70 (m, 2H, CH2), 1.42-1.50(m,3H,CH2,CH),l. 31 (d,J = 7.1Hz,3H,CH3), 0.89-0.96(m,3H,CH3), 0.80-0.86(m,12H,4CH3)〇
[0124] 13C-NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172.01(s),171.73(s),167.43(s), 159.07(s),158.65(s),150.33(s),132.20(s),132.03(s),129.11(s),128.91(2),128.81 (2),126.61(s),126.55(s),101.78(s),67.87(s),57.85(s),51.90(s),49.12(s),47.77 (s),41.22(s),38.56(s),30.88(s),30.27(s),28.83(s),23.72(s),22.86(s),19.52(s), 19.29(s),18.54(s),18.46(s),14.33(s),12.28(s),11.25(s),10.12(s)〇
[0125] ESI-MS calcd for[C37H52N608，M+H]+:709.38，Found:709.46。
[0126] 以上实施例均可由以下反应过程进行概括，本专利中其余化合物均可由相同或近 似过程进行制备：
[0127]
....
[0128] 在对以上实施例彳进行合成时，参考了如下的反应式 U ·
,，、. 、一 (其中化合物下方的一位或二位阿拉伯数字为其编号）：
[0129
[0130」化合物2的制备：
[0131] 将lg氢氧化钠溶于lOmL水中，加入5mL 1，4-二氧六环，在冰浴下冷却后，加入lg化 合物1，然后加入1.83g(Boc)2〇,室温下搅拌8~12小时，用1M盐酸调节pH4-5,之后用乙酸乙 酯萃取，收集乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯得1.67g化合物2,产率 95%〇
[0132] 化合物3的制备：
[0133] 将1.67g化合物2溶于25mL DMF，加入2g无水碳酸钾，反应体系置于冰浴下冷却，然 后加入lmL溴化苄，室温搅拌8~12小时，然后加入少量水，室温搅拌30分钟，将反应体系过 滤，收集滤液，将体系用二氯甲烷稀释，水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除 去溶剂得2.09g化合物3，产率90 %。
[0134] 化合物5的制备：
[0135] 将2.044g化合物3溶于20ml二氯甲烷，然后加入5mL TFA室温搅拌2~4小时，将溶剂减 压蒸去，油栗抽干，得到的油状物溶于20ml二氯甲烷中，反应体系置于冰浴中，冷却后加入 5mL三乙胺，然后加入1.92!
1 .〇g H0BT以及1.46g EDCI，室温搅拌反应过夜。 将反应体系依次用1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，加 入无水硫酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得到2.64g化合物 5,产率90%。
[0136] 化合物7的制备：
[0137] 将0.61g化合物5溶于5mL二氯甲烷中，加入lmL TFA，室温搅拌2~4小时，减压蒸去 溶剂，油栗抽干，得到的油状物用5mL二氯甲烷溶解，之后加入l.lmL三乙胺以及0.25g
后加入0.21g Η0ΒΤ和0.3g EDCI，体系于室温下搅拌过夜反应。反应完毕后 依次用1M的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫 酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，收集有机相蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得〇 . 58g化合物 7,产率83%。
[0138] 化合物9的制备：
[0139] 将470mg化合物7溶于2ml二氯甲烷中，加入0.7mL TFA，室温搅拌2~4小时，反应完 全之后，将溶剂减压蒸去，油泵抽干，将得到的油状物溶于2mL二氯甲烷中，之后依次加入 0.8mL三乙胺、0.11
).14g Η0ΒΤ以及0.2g EDCI，体系于室温下搅拌反应8~12小 时，反应完全之后，依次用1M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，加入无水 硫酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，收集有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得到 〇.418化合物9，产率85%。
[0140] 化合物10的制备：
[0141] 将100mg化合物9溶于lmL THF中，加入9.3mg氢氧化锂，加入2ml水，之后体系搅拌 过夜反应，反应完全后，加入1M盐酸酸化，调节pH4-5，之后减压蒸去溶剂，得到的白色固体 用水洗涤一次，收集固体，真空干燥得l〇〇mg化合物10，产率100%。
[0142] 小分子抑制剂对MERS-CoV ]\Τ°抑制活性研究：
[0143] 一、原理与方法：
[0144] 酶的活性测定：
[0145] 用连续动力学测定冠状病毒主蛋白酶活性，使用荧光标记底物MCA-AVLQSGFR-Lys (Dnp)-Lys_NH2(纯度2 95%，上海吉尔生化有限公司）。用Fluoraskan Ascent焚光仪 (ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)测定焚光强度，激发光和发射光波长分别为320nm 和405nm。
[0146] 酶反应缓冲液体系为50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA。动力学参数是在30°C测 定的。其中Vmax是最大反应速度，[S]是底物的浓度，Km是米氏常数，利用1/V对1/[S]进行线 性拟合即可求得VmajPKm。
[0147] Km的值是指酶促反应速率达到一半时所对应的底物浓度。Km反映的是酶的特性参 数，它的大小与酶浓度无关，只与酶的种类有关，会随着体系中测定的参数变化而变化。Km 越小，酶对底物的亲和力越高。
[0148] 1 /V = 1 /Vmax+Km/Vmax* 1 / [ S]
[0149] 在酶活性参数的实验中，反应时向同一种蛋白酶体系同时分别加入不同浓度的底 物，由此计算主蛋白酶的KdPVmax，底物浓度一般选取5~8个不同的值，荧光强度对时间曲 线用GraphPad Prism 5程序拟合。
[0150] MERS冠状病毒主蛋白酶KjPVmax的测定：
[0151] 在酶反应缓冲液中加入0.5μΜ (终浓度）的MERS冠状病毒主蛋白酶，30 °C孵育lmin， 立即同时加入不同浓度的荧光标记底物[50、40、30、20、10、5、2.5μΜ(终浓度）]，1200rpm/ min，震荡15s，每4s记录一次荧光读数，总时间600s，利用荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism5 程序拟合。得到 Km=41 ·02±5.421yM，Vmax=42.84mol/L/s〇
[0152] 抑制剂活性的测定：
[0153] 当初步筛选实验证明某种抑制剂有效后，我们即开始严格的动力学参数测定。将 时间依赖型抑制剂的反应过程曲线按照一阶指数形式拟合，即可以得到表观一级抑制速率 常数(k-。其中Vo是初始反应速率，P是产物的荧光强度，t为时间，D是为了解决零时刻荧光 强度不为零而引入的位移参量。通过公式（1)可求得k〇bs。在公式(2)中，利用1/1^8对1/[1] 进行线性拟合，即可求得KdPK3,我们用心/心表示二级反应速率常数。其中[I]是抑制剂的 浓度，[S]是底物的浓度，Km是米氏常数，K3是抑制剂使酶失活的反应速率常数，Ki是抑制剂 与酶之间非共价结合的平衡常数。
[0154] P = (vo/k〇bs) (1 -exp (-k〇bs t)) +D (1)
[0155]
[0156] 在抑制剂动力学参数测定实验中，反应时向同一种蛋白酶体系同时分别加入不同 浓度的抑制剂分子(同一抑制剂分子），根据酶活性的高低，底物浓度选择20μΜ，由此计算不 可逆小分子抑制剂的Ki和Κ3的值。
[0157] 抑制剂浓度一般选取5~8个不同的值，荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism 5 程序拟合。
[0158] 化合物N3对MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的测定：
[0159] 用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在终反应体系下终浓度0.5μΜ)，用含有荧光标记底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-LyS-NH2(终 反应体系下终浓度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀释化合物N3[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18，0.88，0· 66,0.50，0·37，0·28，0μΜ(终浓度）]，每个梯度 10μ1，将 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同时加入已配制好的梯度浓度化合物Ν3溶液，1200rpm/s，震荡15s，每6s 记录一次荧光读数，总时间600s，利用荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism 5程序拟合。 Ki = 0 ·4872±0·0871μΜ，Κ3 = 0· 0151 ±0.00083s-^1(3/1 = 0.031^1^8^
[0160] 化合物M14对MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的测定：
[0161] 用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在终反应体系下终浓度0.5μΜ)，用含有荧光标记底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(终 反应体系下终浓度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀释化合物M14[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18,0.88,0.66,0.50,0.37,0.28，0μΜ(终浓度）]，每个梯度 10μ1，将 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同时加入已配制好的梯度浓度化合物Μ14溶液，1200rpm/s，震荡15s，每6s 记录一次荧光读数，总时间600s，利用荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism 5程序拟合。 Ki = 0 · 3050±0 ·0528μΜ，Κ3 = 0 ·0244±0· 0011s-^1(3/^ = 0.080241^8^
[0162] 化合物M18对MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的测定：
[0163] 用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΓ°90μ1(主蛋白酶 在终反应体系下终浓度0.5μΜ)，用含有荧光标记底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(终 反应体系下终浓度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀释化合物M18 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(终浓度）]，每个梯度1(^1，将9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同时加入已配制好的梯度浓度化合物M18溶液，1200rpm/s，震荡15s，每6s 记录一次荧光读数，总时间600s，利用荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism 5程序拟合。 Ki = 0 ·2784±0·0508μΜ，Κ3 = 0·0224±0· 0012s-^1(3/^ = 0.080541^8^
[0164] 化合物M20对MERS-CoV ]?_抑制活性的测定：
[0165] 用缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΓ°90μ1(主蛋白酶 在终反应体系下终浓度0.5μΜ)，用含有荧光标记底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(终 反应体系下终浓度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀释化合物M20 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(终浓度）]，每个梯度1(^1，将9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同时加入已配制好的梯度浓度化合物M20溶液，1200rpm/s，震荡15s，每6s 记录一次荧光读数，总时间600s，利用荧光强度对时间曲线用GraphPad Prism 5程序拟合。 Ki= 1 · 2087±0 · 2533μΜ, K3 = 0 · 05905±0 · 008083s-^1(3/1^ = 0.048841^8^
[0166] 二、结果与分析
[0167] M14、M18、M20对MERS-CoV Mpr。的抑制活性
[0168] 由附图1至附图13可以看出，M14、M18、M20对MERS-CoV Μρ?°都有显著的抑制活性， 结合K3/Ki的值进行比较，本专利中的优选分子对MERS-CoV ΜΡΜ抑制活性均高于Ν3化合物。
[0169] 本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式 将其全部内容包括在本文中。应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常 规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前 的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。本文中所涉及的各种实验 用品（包括但不限于:化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或 者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法;未经特别说明的，均 为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便 地获得。
[0170]应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以 在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂，其特征在于，结构通式为如下通式(I)所示：其中蜗X为NH、0或S中任一种； Ri选自如下基团构成的组:Cl~C6的烷基幾基或者环烷基幾基、叔下氧幾基、苯甲酯基、 异嗯挫基幾基、巧喃基幾基、化咯基幾基、嚷吩基幾基、咪挫基幾基、化挫基幾基、嚷挫基幾 基、化晚基幾基、Ξ氣甲基幾基R2选自如下基团构成的组:Cl~C5的烷基或者环烷基、氨原子、苯基、苄基、对甲基苯基、 氣代苯基、氣代苄基、径甲基R3选自如下基团构成的组:Cl~C5的烷基或者环烷基、氨原子、苯基、苄基、径基、对甲基 苯基、氣代苯基、氣代苄基，R4选自如下基团构成的组:Cl~C6的烷基或者环烷基、氨原子、苯基、苄基、对甲基苯基、 氣代苯基、氣代苄基； Rs选自如下基团构成的组:Cl~C5的烷基或者环烷基、氨原子、苯基、苄基、对甲基苯基、 氣代苯基、氣代苄基。2. 根据权利要求1中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂，其特征在于： Ri优选选自如下基团构成的组：化优选甲基、径甲基或X优选0或NH; R3优选异丙基、叔下基、苄基、苯基、径基、对氣苄基R4优选环己基、异丙基、苯基、氨原子； 化优选异下基。3.根据权利要求2中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂，其特征在于:所述抑制剂 优选自如下成员构成的组：4. 一种权利要求1所述MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤： A、 将通式(II)对应化合物中的氨基保护基R6脱除，其中的R6选自如下基团构成的组:叔 下氧幾基、Ξ氣乙酷基、节氧幾基、赞甲氧幾基、締丙氧幾基； B、 在缩合剂的存在下，将步骤A的产物与通式（III)对应化合物进行缩合，得到通式 (I)，其中，通式（II)和通式（III)中的化、R2、R3、U的定义都与通式（I)中的化、R2、R3、U定义相 同。5. 根据权利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法，包括如下步骤： 在有机溶剂中，使通式（II)对应化合物与酸或碱在室溫下反应2~8小时，脱去氨基的保护 基R6，抽去溶剂，将得到的产物与通式（III)对应化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试 剂和有机碱，在室溫下反应16~24小时，得到通式(I)对应化合物。6. 根据权利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的制备方法，其特征在于： 所述的酸优选Ξ氣乙酸或者盐酸； 所述的碱优选氨氧化钢或甲醇钢； 所述有机溶剂优选选自由如下成员构成的组:C出札、1^、01。、二氧六环； 所述的非质子性溶剂优选自如下成员构成的组:C此〇2、1'邸、01。、二氧六环、二甲亚讽、 苯； 所述的缩合剂优选自如下成员构成的组:HATU、皿TU、EDCI、册BT; 所述的有机碱优选自由如下成员构成的组:LDA、S乙胺、DIEA。7. 权利要求1~3中的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂在制备用于治疗或者预防冠状 病毒感染的药物用途。8. 根据权利要求7所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制剂的用途，其中所述冠状病毒 为中东呼吸综合征冠状病毒、SARS冠状病毒或鼠肝炎病毒中任一种。
【文档编号】A61K31/4025GK105837487SQ201610153875
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月17日
【发明人】饶子和, 傅晟, 杨海涛, 杨诚, 蔡岩, 王喆, 刘贺, 李爽, 徐杨
【申请人】天津国际生物医药联合研究院