磷酸氯喹的药物组合物及其在生物医药中的应用
【专利摘要】本发明公开了磷酸氯喹的药物组合物及其在生物医药中的应用，本发明提供的磷酸氯喹的药物组合物中含有磷酸氯喹和一种从丹参的干燥根茎中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，磷酸氯喹、化合物(Ⅰ)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免疫器官指数，磷酸氯喹和化合物(Ⅰ)联合使用可以进一步提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免疫器官指数，效果优于磷酸氯喹或化合物(Ⅰ)单独作用效果，可以开发成提高免疫力的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
磷酸氯喹的药物组合物及其在生物医药中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及磷酸氯喹的新用途，具体涉及磷酸氯喹的药物组 合物及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 磷酸氯喹为4氨基喹啉类，对疟原虫红细胞内期裂殖体起作用，可能系干扰了疟原 虫裂殖体DNA的复制与转录过程或阻碍了其内吞作用，从而使虫体由于缺乏氨基酸而死亡。 用于治疗对氯喹敏感的恶性疟、间日疟及三日疟。并可用于疟疾症状的抑制性预防。也可用 于治疗肠外阿米巴病、结缔组织病、光敏感性疾病(如日晒红斑)等。
[0003] 迄今为止，尚未见磷酸氯喹及其药物组合物与增强免疫力的相关性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种磷酸氯喹的药物组合物，该药物组合物中含有磷酸氯 喹和一种结构新颖的天然产物，磷酸氯喹和该天然产物可以协同增强免疫力。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0007]
[0008] -种磷酸氯喹的药物组合物，包括磷酸氯喹、如权利要求1所述的化合物（I)和药 学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将丹参的干燥根茎粉碎，用85 ~95%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁 醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇洗脱12个柱体积， 收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用 正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个 组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓 缩得到化合物(I)。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用90%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0013] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0014]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制备增强免疫力的药物中的应用。
[0016] 上述磷酸氯喹的药物组合物在制备增强免疫力的药物中的应用。
[0017]本发明的优点：
[0018] 本发明提供的磷酸氯喹的药物组合物中含有磷酸氯喹和一种从丹参的干燥根茎 中分离得到的结构新颖的天然产物，磷酸氯喹和该天然产物单独作用时，具有增强免疫力 作用;二者联合作用时，增强免疫力效果进一步提高，可以开发成增强免疫力的药物。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0022] 分离方法：（a)将丹参的干燥根茎(2kg)粉碎，用90%乙醇热回流提取(20L X 3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4LX3次）、乙酸乙酯(4LX3次)和水饱和的 正丁醇(4LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇 洗脱12个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70 %乙 醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组 分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积）、5:1(10个柱体积)和2:1(5个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (208mg，HPLC归一化纯度大于98% )。
[0023] 结构确证:针状结晶，册431-1^显示[1+!1]+为111/2 313.1763，结合核磁特征可得 分子式为C2QH24〇3，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm，CDC1 3，500MHz):H-2(2 · 77，m)， H-3a(2.52，m)，H-3b(1.84，dd，J = 7.9,3.5Hz)，H-6(2.37，dd，J=14.7,7.5Hz)，H-7(4.06， d，J = 3.1Hz)，H-8(1.81，dd，J = 5.6,3.1Hz)，H-9(2.07，m)，H-10(2.93，dd，J=ll .4， 2.2Hz)，H-12(6.07，d，J = 10.5Hz)，H-13(6.62，dd，J=10.5,6.6Hz)，H-14(2.84，dd，J = 5.6,6.6Hz)，H-16a(4.78，s)，H-16b(4.74，s)，H-17(1.66，s)，H-18a(4.83，s)H-18b(4.47， 8)，!1-19(1.25，(1，了 = 7.3泡），!1-20(1.22，(1，了 = 7.8抱）；核磁共振碳谱数据6。（卯111，〇0(：13， 125MHz):210.1(C，1-C)，40.2(CH，2-C)，33.4(CH2,3-C)，84.6(C，4-C)，216.9(C，5-C)，43.2 (CH，6-C)，82.3(CH，7-C)，47.2(CH，8-C)，41.3(CH，9-C)，55.2(CH，10-C)，144.6(C，11-C)， 127.5(CH，12-C)，135.7(CH，13-C)，49.3(CH，14-C)，143.8(C，15-C)，114.8(CH 2，16-C)， 18.3(CH3，17-C)，111.7(CH2，18-C)，14.6(CH3，19-C)，16.2(CH3,20-C)。红外波谱表明该化 合物含有羰基（1735cm-1与1675cm-4和烯烃（1632cm-4基团。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示 有20个碳信号，包括三个甲基，三个亚甲基(两个烯烃碳），九个次甲基(一个含氧碳和两个 烯烃碳），以及五个季碳(两个羰基碳、一个连氧碳和两个烯烃碳），以上功能结构再结合不 饱和数表明该化合物为四环结构。h-NMR谱结合HSQC谱显示三个甲基质子信号δΗ 1.66 (3H， 8)、1.25(3!1，(1，1 = 7.3!^)、1.22(3!1，(1，1 = 7.8!^)，一组亚甲基质子信号5[1252(1!1，111)与 1.84(1!1，(1(1，1 = 7.9,3.5抱），两组端烯烃质子信号5114.78(1!1，8)与4.74(1!1，8)、4.83(1!1， s)与4.47(lH，s)，一对烯烃质子信号δΗ 6.07(1!1，(1，1=10.5!^)与6.62(1!1，(1(1，1=10.5， 6.6Hz)，一个连氧次甲基质子信号δΗ 4.06(1Η，d，J = 3.1Hz)。COSY谱中存在Η-12/Η- 13/H-14/H-8/H-7/H-6/H3-20、H-8/H-9/H-10 以及 H2-3/H-2/H3-19 相关信号，同时 HMBC 谱中 显示有 H2-3 与 C-l、C-2、C-5 和 C-10，H-7 与 C-4、C-5、C-9 和 C-20，H2-16 与 C-14，H3-17 与 C-14、 C-15 和 C-16，H2-18 与 C-9、C-11 和 C-12，H3-19 与 C-l、C-2 和 C-3，H3-20 与 C-5、C-6 和 C-7 相关信 号，通过上述NMR谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且可以确定该化合物为 rhamnofolane型二砲类化合物。通过H-12与H-13的偶合常数J= 10.2以及碳化学位移5C129.5与137.2可知C-12和C-13之间为双键。HMBC谱中H-7与C-4、C-5、C-9和C-20的相关信号 与1H-1!! COSY谱中H-9/H-10以及H-8/H-7相关信号可确证C-4和C-7连氧桥环的存在。R0ESY 谱中，H-7 与 Me-20、Me-17 和 H-8，H-8 与 H-10，H-9 与 H-14 的相关性表明 H-7、H-8、H-10 和 Me-20 为β构型，H-9和H-14为α构型。此外，通过查阅文献(Naengchomnong et al. ,1986)对比碳化 学位移可知Me-19构型应该为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关 类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值 与实验值基本一致。该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0024]
[0025] 实施例2:药理作用 [0026] 1、材料与方法
[0027] 1.1动物
[0028] 清洁级昆明种小白鼠120只，体重20±2g，雌雄各半，四川农业大学实验动物中心 提供。
[0029] 1.2试剂与样品
[0030] 磷酸氯喹购自中国食品药品检定研究院。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。环 磷酰胺（cyclophosphamide，CTX)(江苏恒瑞），黄芪多糖(APS，江苏华东贝尔生物药业），台 盼蓝（Sigma)，RPMI1640培养液(Hyclon)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma)，脂多糖（LPS，Sigma)， MTT(Sigma)，二甲亚砜(DMSO)，pH7.2roS，5%鸡红细胞(CRBC)，豚鼠血清（广州蕊特生物）， 小鼠细胞因子IL-2, IL-4和IFN- γ 检测试剂盒(BOSTER)，CD3+(FITC Hamster anti-mouse) 单克隆抗体，CD4+(PE rat anti-mouse)单克隆抗体，CD8+(PerCP rat anti-mouse)单克隆 抗体（B0STER)，溶血素（Versalyse? Lysing Solution)。
[0031] 1.3仪器
[0032] 紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器），流式细胞仪（BD FACSCcalibur TM)，超净工作台（AIRTECH)，倒置显微镜(Motic)，离心机(Thermo)，酶联免疫检测仪(BI0- RAD )，C02培养箱(Thermo)。
[0033] 1.4动物分组及处理
[0034]将60只健康小鼠随机分空白组、模型组、阳性组、磷酸氯喹组、化合物（I)组、磷酸 氯喹与化合物（I)组合物组，每组10只。空白组和模型组每天腹腔注射生理盐水0.2ml、阳性 组每天腹腔注射20g · I/1 APS 0.2ml，磷酸氯喹组、化合物（I)组、磷酸氯喹与化合物（I)组 合物组分别每天腹腔注射磷酸氯喹20g · Γ1、化合物（I)20g · Γ1、磷酸氯喹与化合物（I)组 合物【磷酸氯喹20g · I/1-化合物（I)20g · 1/1】0.21111，连续7(1;给药后(15~7，除空白对照组 外其余各组每天腹腔注射CTX lOOmg.kg^1。
[0035] 1.5腹腔巨噬细胞功能及免疫器官指数检测
[0036] 按"1.4"处理，各组分别于给药后d7称重，并腹腔射5 %鸡红细胞0.5ml，8h后处死 小鼠，腹腔注入PBS 2ml，轻揉小鼠腹部lmin，吸取腹腔液体0.5ml于载玻片上在37 °C孵育 30min，1:1丙酮-甲醇液固定5min，Giemsa染色，每张涂片油镜下计数200个巨细胞，按以 下公式计算吞噬率和吞噬指数：
[0037] 吞噬率/% = (吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞数）X 100% ;
[0038] 吞噬指数=(被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞数）+2。
[0039] 另取各组小鼠脾和胸腺称重，按以下公式计算：
[0040] 脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g);
[0041] 胸腺指数=胸腺重量(mg) /体重(g)。
[0042] 1.6数据统计分析
[0043]采用SPSS 19.0分析软件进行数据统计，方差分析组间差异。
[0044] 2、实验结果
[0045] 2.1对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能和免疫器官指数的影响
[0046]与空白组比较，模型组的各项指标均明显降低(P<0.01)。与模型组相比，阳性组 的黄芪多糖(APS)、磷酸氯喹组、化合物（I)组均能明显提高吞噬率和吞噬指数(P<0.05); 与模型组相比，磷酸氯喹与化合物（I)组合物组小鼠的吞噬率、吞噬指数、脾脏指数和胸腺 指数均明显升高(P<〇. 01)。结果见表1。
[0047]表1对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞功能和免疫器官指数的影响
[0048]
'[0049] 上述结果表明，磷酸氯喹、化合物（I)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功能和免 疫器官指数，磷酸氯喹和化合物（I)联合使用可以进一步提高免疫抑制小鼠的巨噬细胞功 能和免疫器官指数，效果优于磷酸氯喹或化合物（I)单独作用效果，可以开发成提高免疫力 的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
[0050]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)， 2. -种憐酸氯哇的药物组合物，其特征在于:包括憐酸氯哇、如权利要求1所述的化合 物(I)和药学上可W接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的憐酸氯哇的药物组合物，其特征在于:药学上可W接受的载体 包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体 或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的憐酸氯哇的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、胶 囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、 栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将丹 参的干燥根茎粉碎，用85~95%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中正下醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用 70%乙醇洗脱12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b) 中70 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为8:1、5:1和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基 硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱 体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用90%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烧代 替乙酸乙醋进行萃取，得到二氯甲烧萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备增强免疫力的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的憐酸氯哇的药物组合物在制备增强免疫力的药物中的应 用。
【文档编号】A61P37/04GK105837594SQ201610264067
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】徐挺
【申请人】徐挺