一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及多肽药物领域，具体涉及一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用。本发明所述东方铃蟾多肽ABP27具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。实验结果表明本发明所述ABP27对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、痤疮杆菌、动物致病大肠杆菌、白色念珠菌、清酒酵母菌均有良好的抗菌活性。且防腐性良好，可作为防腐剂替代品使用。同时ABP27具有抑制痤疮丙酸杆菌的炎症反应作用。本发明所述东方铃蟾多肽ABP27可以用于制备抗菌的药物或化妆品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。
【专利说明】
一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及多肽药物领域，具体涉及一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 近年来随着抗生素的滥用，抗药菌越来越多，细菌耐药性日益严重。据资料显示， 在美国临床上分离到的金葡菌有95%对青霉素耐药，50%以上对甲氧西林耐药(Frindkin SK,Gaynes RP. Antimicrobial resistance in intensive care units .Clin Chest Med. 1999,20(2) :303-316)。2012年我国临床检测发现，金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中甲 氧西林耐药株(MRSA和MRCNS)的检出率平均分别为47.9 %和77.1 % (2012年中国CHINET细 菌耐药性监测Chin J Infect Chemother，2013，13(5):321-330)。这种情况严重威胁着人 类的生产生活，从而导致人们对此潜在威胁意识的觉醒及食品安全级别意识的提高，人们 迫切需要绿色环保、安全、抗耐药的新一代抗生素，以替代现有的抗生素。
[0003] 抗菌肽是生物体内免疫防御系统的重要组成部分，是一类小分子肽，被称为安全 的天然抗生素，具有抗菌谱广、无耐药性、热稳定好、水溶性高、无毒无残留等优点。据统计， 目前我国尚有多达20种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂，除此之外，抗菌肽被 广泛用于化妆品、食品保鲜剂、药物、转基因表达等与人类生产生活当中。将抗菌肽产品开 发成新的代替传统抗生素的产品，将有效解决现有的抗生素细菌耐药性严重的问题。
[0004] 两栖类动物皮肤裸露，柔软而湿润，体表富含腺体，其皮肤分泌物含有大量的具有 特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性分子。从两栖类己经分离到的包括血管紧张素样 肤、促甲状腺素释放肤、蛙啡肤、舒缓激肤样多肤、速激肤样多肤、雨蛙肤样多肽等14类多肤 家族以及生物胺生物碱等。东方铃蟾(Bombina oriental is)，别名火腹铃蟾、臭蛤蟆、红肚 皮蛤蟆，属盘舌蟾科、铃蟾属，是一种极有开发潜力的药用无尾目两栖动物，主要分布于中 国的东北及俄罗斯，朝鲜和日本，多生活在池塘或山区溪流石下。其皮肤腺体发达，受刺激 能大量分泌富含活性物质的粘液，是分离生物活性分子的优良来源。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种东方铃蟾多肽，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0008] 本发明还提供了在所述东方铃蟾多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多 个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。
[0009] 本发明也提供了编码本发明所述多肽的DNA分子。
[0010] 本发明还提供了所述东方铃蟾多肽的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 1)固相合成ABP27-氨基树脂；
[0012] 2)ABP27-氨基树脂裂解得到ABP27粗肽；
[0013] 3)ABP27粗肽用1 %醋酸溶液溶解后，凝胶柱层析分离得到ABP27精肽。
[0014] 优选的，所述固相合成为Fmoc-Arg(Pbf )-OH和氨基树脂反应合成Fmoc-Arg(Pbf)- 氨基树脂，然后采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸得到ABP27-氨基树 脂。
[0015]其中，所述氨基树脂优选为Rink Amide树脂。
[0016] 本发明所述制备方法步骤2)所述裂解的裂解剂为氟乙酸、三异丙基硅烷与苯酚的 混合物。
[0017] 优选的，所述三氟乙酸、三异丙基硅烷与苯酚的体积比为95:2.5:2.5。
[0018]因此，本发明提供了所述多肽ABP27在制备抗菌的药物中的应用。
[0019]进一步的，本发明还提供了所述多肽ABP27在制备抗菌的化妆品中的应用。
[0020] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用。本 发明所述东方铃蟾多肽ABP27具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，不含有稀有氨基酸和外 源化学成分，具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶 的降解。特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，可以在 产品保存过程中持续发挥其功能，保持产品品质，延长贮存期限。实验结果表明本发明所述 ABP27对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、痤疮杆菌、动物致病大肠杆菌、白色念珠菌、清酒 酵母菌均有良好的抗菌活性，且防腐性良好，可以作为新一代的添加剂，是很好的传统抗生 素和防腐剂替代品，能有效得解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题，并且可成为新型 的安全的防腐剂替代品。同时ABP27具有抑制痤疮丙酸杆菌的炎症反应作用。本发明所述东 方铃蟾多肽ABP27可以用于制备抗菌的药物或化妆品，应用范围广泛，具有良好的经济和社 会效应。
【附图说明】
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022]图1示实施例2合成抗菌肽ABP27对金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌、大肠杆菌DH5a和动 物致病大肠杆菌的抗菌实验结果；各图中1表示氨苄青霉素的抗菌活性，0为阴性对照 ddH20,2、3、4为人工合成抗菌肽ABP27的抗菌活性；
[0023] 图2实施例2合成抗菌肽ABP27对白色念珠菌和清酒酵母菌的抗菌实验结果;各图 中1表示伊曲康唑的抗菌活性;0为阴性对照ddH20，2、3、4为人工合成抗菌肽ABP27的抗菌活 性。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0025] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0026] 一种东方铃蟾多肽，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0027] 本发明所述东方铃蟾多肽具体序列为GIGGKLLTAGKTAKKGLAKGLK EHFAN，分子量约 MW[AV]: 3kDa，命名为ABP27，不含有稀有氨基酸和外源化学成分，具有免疫原性小、水溶性 好、广谱杀菌等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。特别是在酸性条件下，加热甚 至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，可以在产品保存过程中持续发挥其功能，保持 产品品质，延长贮存期限。
[0028] 本发明还提供了在所述东方铃蟾多肽ABP27的氨基酸序列中取代、缺失或添加一 个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在 氨基酸序列的任意位点进行，只要改造后的氨基酸序列的多肽具有抗菌活性即可。类似的， 所取代、缺失或添加的氨基酸的数目也是任意的，只要改造后的氨基酸序列的多肽具有抗 菌活性。
[0029] 本发明也提供了编码本发明所述多肽的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在 很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。对于编码本发明所述多肽的DNA分 子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构 成所述的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于所述多肽的氨 基酸序列的DNA分子。
[0030] 本发明还提供了所述东方铃蟾多肽ABP27的制备方法，包括以下步骤：
[0031] 1)固相合成ABP27-氨基树脂；
[0032] 2)ABP27-氨基树脂裂解得到ABP27粗肽；
[0033] 3)ABP27粗肽用1%醋酸溶液溶解后，凝胶柱层析分离得到ABP27精肽。
[0034]其中，本发明所述制备方法步骤1)采用Fmoc/tBu合成策略，以合适替代度的氨基 树脂为载体，逐个偶联Fmoc保护基团的氨基酸固相合成得到ABP27-氨基树脂。
[0035] 优选的，所述固相合成为Fmoc-Arg(Pbf )-OH和氨基树脂反应合成Fmoc-Arg(Pbf)- 氨基树脂，然后采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸得到ABP27-氨基树 脂。
[0036]其中，所述氨基树脂优选为Rink Amide树脂。进一步的，本发明所述制备方法所述 逐一偶联的Fmoc保护基团的其他氨基酸依次为：
[0037] Gly-Ile-Gly-Gly-Lys-Leu-Leu-Thr-Ala-Gly-Lys-Thr-Ala-Lys-Lys-Gly-Leu- Ala_L ys-Gly-Leu-Lys-Glu-His-Phe-Ala-Asn(即：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖 氨酸-亮氨酸-亮氨酸-苏氨酸-丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘 氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸- 天冬酰胺）。
[0038]其中，上述Fmoc保护基团的氨基酸可以通过商品销售渠道购买，也可利用已商品 化的原料按照本领域技术人员已知的方法制备得到。
[0039] 在某些【具体实施方式】中，步骤1)所述逐一偶联的方式中每一个氨基酸的偶联方法 具体包括以下步骤：
[0040] a、洗涤:DMF、DCM和甲醇交替洗涤2到3次；
[0041 ] b、脱保护：用20%的哌啶/01^溶液室温处理2-3次，每次5-1511^11，脱去?111〇(3-保护 剂，KaiseH式剂检测反应是否完全；
[0042] c、洗涤:DMF、DCM和甲醇交替洗涤2到3次；
[0043] d、氨基酸偶联:将Fmoc-保护氨基酸、H0Bt、DIC用适量DMF溶解后，加入反应柱中， 与树脂混合搅拌2-4h，KaiseH式剂检测反应是否完全。
[0044] 本发明所述制备方法步骤2)通过裂解剂裂解ABP27-氨基树脂，得到ABP27粗肽。其 中，所述裂解的裂解剂为三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(Tis)与苯酚(Pheno 1)的混合物。 [0045]优选的，所述三氟乙酸、三异丙基硅烷与苯酚的体积比为95:2.5:2.5。
[0046] 本发明所述制备方法步骤3)ABP27粗肽用1%醋酸溶液溶解后，凝胶柱层析分离得 到ABP27精肽。
[0047] 在一些实施例中，所述凝胶柱层析分离具体为以1%醋酸溶液洗脱，在220nm监测， 上样量2.00g/次，流速为5mL · mirT1，收集有吸收的组分。将收集的精制液减压蒸馏，控制质 量浓度在l〇〇mg · ml/1左右时冷冻干燥。
[0048]为了提高制得的ABP27多肽的纯度，在一些实施方案中，本发明所述制备方法步骤 3)还包括ABP27多肽纯化步骤。
[0049] 优选的，所述纯化为反相高效液相色谱纯化。
[0050] 反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquid chromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。 它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱)相反。RP-HPLC 是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机 物的分离纯化。
[0051] 本发明步骤3)所述反相高效液相色谱法的流动相可以为三氟乙酸水溶液、甲酸水 溶液或醋酸水溶液。
[0052]在一些具体实施例中，步骤3)所述反相高效液相色谱法的流动相A为0.1%三氟乙 酸水溶液，流动相B为0.1 %三氟乙酸乙腈溶液。
[0053] 本发明步骤3)所述反相高效液相色谱法所用的填料可以为十八烷基硅烷键合硅 胶(C18)、丁基硅烷键合硅胶(C4)或八烷基硅烷键合硅胶(C8)，优选为十八烷基硅烷键合硅 胶。
[0054] 在某一【具体实施方式】中，本发明步骤3)所述反相高效液相色谱纯化的色谱条件 为：制备柱：C18制备柱（50 X 80mm);流速：100ml/min;波长：220nm;流动相：22-28 %B in 10m i η，流动相A: 0.1 %三氟乙酸水溶液，流动相B: 0.1 %三氟乙酸乙腈溶液。
[0055] 在某一具体实施例中，本发明采用平板培养法对合成抗菌肽ABP27进行抗菌谱的 测定，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、痤疮杆菌、动物致病大肠杆菌、白色念球菌、清 酒酵母菌均有良好的抗菌活性。采用倍比稀释的方法配制不同浓度的ABP27溶液，加入到培 养菌液中培养16h后测0D630值，确定人工合成ABP27对不同菌株的最小抑菌浓度MIC。
[0056] 进一步，本发明采用美国药典的微生物防腐功效测试方法，对添加0.01%ABP27的 膏霜进行防腐功效测试，结果显示添加 ABP27的无防腐剂的化妆品样品细菌总数、霉菌与酵 母菌总数均符合《美国药典USP32〈51>》的要求，说明该抗菌肽防腐性良好，可作为防腐剂替 代品使用。
[0057]在另一具体实施例中，本发明通过小鼠痤疮模型对添加不同浓度ABP27的膏霜进 行抑制痤疮杆菌引起的炎症反应的检测，结果显示ABP27低、中、高剂量组及维A酸乳膏组大 鼠的耳肿胀率明显降低，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P〈〇.05、P〈0.01)，表明 ABP27具有抑制痤疮丙酸杆菌的炎症反应作用。
[0058]因此，本发明提供了所述多肽ABP27在制备抗菌的药物中的应用 [0059]本领域技术人员可将本发明所述多肽ABP27直接或间接加入制备不同剂型时所 需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂 方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、膏剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄 糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳 酸钠，低取代羟丙基纤维素;润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫 酸钠;粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。
[0060] 进一步的，本发明还提供了所述多肽ABP27在制备抗菌的化妆品中的应用。
[0061] 本领域技术人员可将本发明所述多肽ABP27直接或间接加入制备不同化妆品时所 需的原料，以化妆品制备方法，制成常用化妆品如乳液、面霜、精华液等。
[0062] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种东方铃蟾多肽及其制备方法与应用。本 发明所述东方铃蟾多肽ABP27具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，不含有稀有氨基酸和外 源化学成分，具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶 的降解。特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，可以在产 品保存过程中持续发挥其功能，保持产品品质，延长贮存期限。实验结果表明本发明所述 ABP27对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、痤疮杆菌、动物致病大肠杆菌、白色念珠菌、清酒 酵母菌均有良好的抗菌活性，且防腐性良好，可以作为新一代的添加剂，是很好的传统抗生 素和防腐剂替代品，能有效得解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题，并且可成为新型 的安全的防腐剂替代品。同时ABP27具有抑制痤疮丙酸杆菌的炎症反应作用。本发明所述东 方铃蟾多肽ABP27可以用于制备抗菌的药物或化妆品，应用范围广泛，具有良好的经济和社 会效应。
[0063] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中，除特 别说明外，本发明所述制备方法中所述试剂是本领域技术人员公知的，可以通过商业途径 购买得到。
[0064] 实施例1:多肽ABP27的制备
[0065] 1、Fmoc_Arg(pbf)-氨基树脂的制备
[0066] 将替代度0.84mmol/g氨基树脂Fmoc-Rink Amide 10.03g，加入到固相反应器中， 加入DMF浸泡，使其充分溶胀30min，抽干，加20 %哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基团2次，第一次 反应5min，第二次反应15min，用DMF、DCM、甲醇洗涤干净。取11 · lg Fmoc_Arg(Pbf )-〇H， 2.24gH0Bt，6.14gHBTU用DMF溶解后加入到反应器中平衡5min，加入6. OmLDIPEA室温反应1 小时，抽干，先后用DMF、DCM、甲醇各洗涤3次，干燥称重得Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide树脂 17.12g，检测取代度为0.67mmol/g。
[0067] 2、ABP27氨基树脂的制备
[0068]将上述树脂放于接肽瓶中，加入20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基团2次，第一次反 应5min，第二次反应15min，用DMF、DCM、甲醇洗涤干净。。然后按序列 GIGGALLSAGKSALKGLAKGLAEHFAN-NH2的顺序依次接Fmo c保护的氨基酸，反应体系摩尔比为 Fmoc -AA: DIC: HOBt按1:1:1投放，在此例中Fmoc-AA按树脂量的3倍加入，每次DIC加4.10g 左右，HOBt加4.27g左右。期间依次20 %哌啶/DMF脱除Fmoc保护基团2次，第一次反应5min， 第二次反应15min;每一步氨基酸缩合反应一次2 - 4小时，均采用Kaise Test检测反应是否 缩合完全，如显色反应呈阳性重复缩合该氨基酸，序列缩合最后直接脱除Fmoc保护基团， DMF、DCM、甲醇洗涤几次。
[0069] 3、ABP27粗品的制备
[0070] ABP27氨基树脂用TFA: Tis: Phenol按体积比95:2 · 5:2 · 5的混合溶液处理肽树脂3- 4小时，把肽从树脂上切下来及切除侧链保护基，浓缩至干后用冰乙醚析出固体，离心干燥 得粗品29.51g。
[0071] 4、ABP27成品的制备
[0072] ABP27粗品用1 %醋酸溶液溶解后，离心取上清过G10柱，以1 %醋酸溶液洗脱，在 220nm监测，上样量2.00g/次，流速为5mL · mirT1，收集有吸收的组分。将收集的精制液减压 蒸馏，控制质量浓度在l〇〇mg · ml/1左右时冷冻干燥。收集抗菌肽ABP27峰浓缩干燥得成品 17.71g。纯度大于60%，总收率达60 %。
[0073]实施例2:ABP27抗菌谱的测定
[0074]从YPD平板上分别挑取PCR鉴定为阳性的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、痤疮杆 菌、动物致病大肠杆菌、白色念珠菌、清酒酵母菌单菌落接种于l〇〇mlBMGY培养基，30°C振荡 培养至0D600 2~6，去上清，加入20mlBMMY培养基重悬菌体，30 °C振荡培养96小时，每隔24 小时取lmL样品于Eppendorf f管中，取上清用于抗菌活性检测。
[0075]将琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50°C左右，用无菌操作法吸取60yL的生 测菌(0D600 = 0.3)，加入20mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9cm的无菌平面皿内， 水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7_的圆孔，分别在孔中加入用磷酸盐缓冲液配制的 合成ABP27，无菌水和100mg/mL Amplicin。将平皿倒置于37°C培养过夜，次日观察结果，如 图1和图2所示
[0076] 结果显示，人工合成的ABP27对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、痤疮杆菌、动物致 病大肠杆菌、白色念珠菌、清酒酵母菌均有良好的抗菌活性。
[0077] 实施例3:人工合成ABP27最小抑菌浓度(MIC)的测定
[0078] ΜIC测定方法：将实施例2各测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约5 X 106CFU/mL，加入96孔培养板中，测试孔每孔加入菌液90yL，然后加入倍比稀释的不同浓度 的合成抗菌肽溶液，1〇μL7孔。阳性对照为100此/孔的菌液，阴性对照为相应的100yL培养 基。然后于37°C慢摇培养约16h，用酶标仪测0D630。抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果 见表1。
[0079] 表1人工合成抗菌肽ABP27的MIC
[0080]
[0081 ]实施例4:人工合成ABP27的防腐剂替代实验
[0082]实验参考化妆品、盥洗用品与香料协会(CTFA)及美国药典的微生物防腐功效测试 方法，即将一定量的微生物悬浊液加入到化妆品中，每隔一定时间用平板计数法检测微生 物的存活情况，以此判断防腐剂的防腐效果。
[0083]培养方式为纯培养。分别称量20g已制备好的无防腐剂化妆品样品于无菌瓶中，纯 度为95%ABP27的添加量为0.01 %。每瓶中分别加入每种菌悬液0.2mL，充分震荡混匀后，于 室温存放。于第〇、1、7、14、21、28天用平板计数法检测微生物的生长情况。
[0084]评价标准参考《美国药典USP32〈51>》:细菌总数从初始到14天的细菌数对数减少 值不能小于2.0并且从114天到28天细菌数不能增加;霉菌与酵母菌总数从初始到14天和28 天，霉菌与酵母菌不能增加，判断为防腐剂防腐效果良好。实验结果见表2。
[0085]表2微生物的存活情况 [0086]
[0087]从实验结果可以看到，添加 ABP27的无防腐剂的化妆品样品细菌总数从初始到14 天对数减少值为2.98，并且到28天减少值为大于6.60，霉菌与酵母菌总数从初始到14天和 28天，对数减少值为0.99和1.48，因此符合《美国药典USP32〈51>》的要求，说明该抗菌肽防 腐性良好，可作为防腐剂替代品使用。
[0088] 实施例5:小鼠痤疮模型实验
[0089]选取健康SD大鼠50只，雌性，200 ± 20g。检疫合格后，随机分成7个组，分别为正常 对照组，空白基质组，阳性药维A酸乳膏组，模型对照组，ABP27软膏低、中、高剂量组（即往空 白基质中添加低、中、高浓度的ABP27)，每组6只大鼠，其余留作预实验，每组1-2只，用于痤 疮丙酸杆菌验证等实验。
[0090]实验前先在厌氧培养箱里进行丙酸痤疮杆菌扩大培养。将购买的丙酸杆菌冻干粉 用生理盐水复溶后，在厌氧条件下，以硫乙醇钠液培养基增菌扩大培养，待到指数生长期 时，先用生理盐水洗涤3次，末次用生理盐水调整痤疮丙酸杆菌浓度为6000万/mL，制成痤疮 丙酸杆菌备用液，95°C水浴灭活15min后备用。
[0091] 实验开始时，先将大鼠用12.5%的乌拉坦麻醉后，正常对照组和空白基质组大鼠 耳廓皮内注射生理盐水50yL，其余各组大鼠耳廓皮内注射痤疮丙酸杆菌菌液50yL，并在注 射处做标记，于制备第2天，从各组抽取1只验证大鼠，用无菌针头挑取耳廓肿胀部位，涂皿， 厌氧罐中培养48h，证明为痤疮丙酸杆菌感染。造模成功后，各组大鼠耳廓分别给药，正常对 照组仅涂生理盐水，空白基质组给予等体积的无防腐剂基质，其它各组按表3剂量给药，连 续给药15天，每天2次，每次给药0.2g，涂抹于大鼠的耳肿胀部位。注射后，每隔24小时测量1 次大鼠耳廓厚度，连续5d，计算各鼠耳廓肿胀率，观察大鼠耳廓结构变化。将各组实验结果 进行统计学处理，并比较组间差异。实验结果见表4和表5。
[0092] 耳廓肿胀率（％ )=(注射后耳廓厚度-注射前耳廓厚度注射前耳廓厚度 [0093] 表3痤疮模型实验的加药剂量表
[0094]
[0095] 表4大鼠注射痤疮丙酸杆菌前及注射后连续5d、第14d的耳廓厚度结果（〗:tSD,n = 6)
[00961
[0097] 表5大鼠注射痤疮丙酸杆菌前以及注射后连续5d、第14d的耳廓肿胀率(? 士 SD,n = 6)
[0098]
[0099] 注:与空白对照组相比Λρ>0 · 05，*p〈0 · 05 ,#p〈0 · 01，*#p〈0 · 001 (t检验）。
[0100] 从表4表5实验结果可得，大鼠注射痤疮丙酸杆菌后5d耳朵明显肿胀，一直到给药 第14d，耳廓肿胀率与同期正常对照组相比，具有显著性差异(P〈0.001)，提示痤疮丙酸杆菌 耳注射造模成功。空白基质组大鼠的耳廓肿胀率与正常对照组相近，提示空白基质无消炎 作用，仅作为配药基质存在。ABP27低、中、高剂量组大鼠耳廓注射座疮丙酸杆菌后，出现明 显的肿胀现象，但计算肿胀率与同期模型对照组相比，具无显著性差异(P>〇.05);在给药第 14d时，ABP27低、中、高剂量组及维A酸乳膏组大鼠的耳肿胀率明显降低，与同期模型对照组 相比，具有显著性差异(？〈0.05、？〈0.01)，表明48?27受试样品具有一定的抑制痤疮丙酸杆 菌的炎症反应作用，维A酸乳膏的作用与临床应用相符合。因此可以看到ABP27可以有望应 用于痤疮杆菌引起的炎症反应。
[0101]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，本发明所属技术领域的 技术人员可以做出若干推演或替换，都应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种东方铃蟾多肽，其特征在于，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。2. 具有通过在权利要求1所述东方铃蟾多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或 多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。3. 编码权利要求1或2所述多肽的DNA分子。4. 权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)固相合成ABP27-氨基树脂； 2 )ABP27-氨基树脂裂解得到ABP27粗肽； 3. ABP27粗肽用1 %醋酸溶液溶解后，凝胶柱层析分离得到ABP27精肽。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述固相合成为Fmoc-Arg (Pbf)-OH和氨基树脂反应合成Fm〇C-Arg(Pbf)-氨基树脂，然后采用逐一偶联的方式偶联 Fmoc保护基团的其他氨基酸得到ABP27-氨基树脂。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氨基树脂为Rink Amide树脂。7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述裂解的裂解剂为三氟乙 酸、三异丙基硅烷与苯酚的混合物。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸、三异丙基硅烷与苯酚 的体积比为95:2.5:2.5。9. 权利要求1或2所述多肽在制备抗菌的药物中的应用。10. 权利要求1或2所述多肽在制备抗菌的化妆品中的应用。
【文档编号】A61K8/64GK105837674SQ201610131481
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月8日
【发明人】华洋林, 梁东, 李莉楠, 唐健
【申请人】无限极（中国）有限公司