多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用
【专利摘要】本发明涉及多肽及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。本发明的多肽的序列为：igvgvgagayilaryalnhp。通过静脉注射本发明的肽使其穿透血脑屏障，进入星形胶质细胞，增加细胞内Na+/K+?ATPase β1的稳定性，促进Na+跨膜浓度梯度形成和维持，谷氨酸摄取能力明显增强。缺血性脑卒中病理过程中伴随谷氨酸的大量堆积，运用本发明的多肽治疗，可以减轻缺血损伤。
【专利说明】
多化及其用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体设及多肤NDRG2141-160、连接TAT制备TAT-NDRG2141-16G融合肤段，W及该融合肤段穿过血脑屏障与化Vr-ATPasem结合，促进星形胶 质细胞谷氨酸摄取能力，并有效降低脑细胞外液兴奋性神经递质谷氨酸的浓度。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸是中枢神经系统含量最多的兴奋性神经递质，主要由突触前膜释放，与突 触后膜上的谷氨酸受体结合，介导神经元兴奋和兴奋传递。突触间隙的谷氨酸必须保持在 较低的浓度，从而保证谷氨酸受体的高度敏感W及避免谷氨酸堆积诱发的兴奋性毒性损 伤。多种神经系统病变，包括急性脑缺血和脑外伤、慢性神经退行性疾病如阿尔茨海默病、 癒痛等均与脑中兴奋性神经递质谷氨酸诱发的兴奋性神经毒性损伤有关。目前针对兴奋性 毒性损伤的治疗，主要集中在突触后膜的谷氨酸受体，比如开发了一系列醒DAR(-种谷氨 酸受体)括抗剂，如美金刚等。但是运类谷氨酸受体括抗剂对缺血性脑卒中患者的临床疗效 不佳，有很多副作用，可能与括抗剂彻底阻断谷氨酸的生理效应有关。因此，对于缺血性脑 卒中的治疗，急需寻找新的、更安全、更有效的药物祀点。
【发明内容】
[0003] 由于突触间隙缺乏使谷氨酸失活的酶，谷氨酸的清除主要依赖突触周围的星形胶 质细胞膜上的谷氨酸转运体摄取多余的谷氨酸。谷氨酸转运体摄取谷氨酸的同时将化+同 向转运到星形胶质细胞内，因此跨细胞膜的化+浓度差驱动着谷氨酸的摄取。而分布于星形 胶质细胞膜表面的化Vr-ATPase负责将细胞中的化+转运到细胞外，维持跨细胞膜的Na+浓 度差。如果从星形胶质细胞摄取谷氨酸的角度考虑增加其摄取能力，有可能减轻谷氨酸介 导的兴奋性神经损伤。
[0004] NDRG2(Human N-myc downstream regulated gene 2)基因主要在哺乳动物星形 胶质细胞中表达。发明人在前期研究中发现NDRG2可W与NaVK+-ATPasePl亚基相互作用，促 进化VK+-AlTase的酶活性和Na+转运。Na Vf-AlTasem亚基是化VlC-AlTase的组成性亚 基，可W促进全酶正确定位于细胞膜发挥其酶活性。发明人还发现，NDRG2通过与化7r-AlTasem亚基相互作用，调节星形胶质细胞摄取谷氨酸。发明人进一步筛选到NDRG2141-160 运20个氨基酸片段是其与化Vr-ATPasePl相互作用并稳定化Vr-ATPasePl、促进谷氨酸 摄取的关键片段。用该关键片段处理星形胶质细胞，可W增强Na Vr-ATPasePl蛋白稳定性、 促进NaVK+-ATPase介导的Na+转运、促进谷氨酸摄取。
[0005] 为此，本发明的目的之一是提供一种多肤。
[0006] 本发明所提供的多肤序列为：igvgvgagayilaryalnhp。
[0007] 本发明的目的之二是上述多肤用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。 [000引本发明的目的之S是上述多肤用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
[0009]考虑到大于6个氨基酸的多肤一般不能穿过血脑屏障，难W在脑内达到有效的蛋 白浓度。本发明目的之四是提供一种融合肤。
[0010] 本发明的融合肤包括穿膜肤和权利要求1所述多肤，所述穿膜肤为TAT、VP22、 AntP、Polyarginine或Polylysine。
[0011] -种实施方式中，本发明融合肤的氨基酸序列为：
[0012] YGRKKRRQRRRigVgVgagayiIaryaInhp。
[0013] 本发明目的之五是提供上述融合肤用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应 用。
[0014] 本发明目的之六是提供上述融合肤用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
[0015] 通过静脉注射本发明的肤使其穿透血脑屏障，进入星形胶质细胞，增加细胞内化 Vr-ATPasePl的稳定性，促进化+跨膜浓度梯度形成和维持，谷氨酸摄取能力明显增强。缺 血性脑卒中病理过程中伴随谷氨酸的大量堆积，运用TAT-NDRG2141-160融合肤治疗，脑细胞 外液谷氨酸浓度明显降低，脑缺血损伤明显减轻。
【附图说明】
[0016] 图1:高效液相色谱检测TAT-NDRG2141-16日融合肤纯度大于99% ;
[0017] 图2:体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可W与NaYr-ATPasePl亚基相互作用；
[0018] 图3:将NDRG2逐步截短并利用免疫共沉淀筛选出其与化Vr-ATPasePl相互作用的 位点位于NDRG2蛋白的141-239肤段中；
[0019] 图4:将NDRG2蛋白的141-239肤段进一步截短并连接TAT穿膜肤段：
[0020] TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2i8i-2〇o，TAT-NDRG2201-220，
[0021] TAT-NDRG2221-239,在体外培养的星形胶质细胞中利用免疫共沉淀证实 [00剖 TAT-NDRG2141-16网W显著干扰内源性NDRG2与化Vr-ATPasem亚基相互作用；
[0023] 图5: TAT-NDRG2141-16日处理体外培养的星形胶质细胞，能明显增加化+/T-ATPasePl 蛋白的稳定性和半衰期；
[0024] 图6:使用绿色巧光素 FITC标记的谷氨酸(FITC-Glu)检测星形胶质细胞对于谷氨 酸的再摄取，发现TAT-NDRG2141-16日处理后与对照肤段处理组相比，谷氨酸摄取明显增加；
[00巧]图7:微透析实验证实，使用TAT-NDRG2141-160处理后，脑缺血再灌注模型小鼠脑外 液谷氨酸含量与对照肤段比明显降低；
[00%] 图8:TTC染色显示TAT-NDRG2l4l-l6日处理组，脑缺血再灌注模型小鼠脑梗死体积明 显减少。
【具体实施方式】
[0027] W下实验中所选用穿膜肤为TAT，携带与其融合的肤段穿透血脑屏障并进入细胞 膜，实现该功能的穿膜肤还有VP22、An巧、Polyarginine或Polylysine等。实施例1:多肤的 构建
[002引发明人前期研究发现在体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可W与化+/r-ATPase化 亚基相互作用（图2)，并抑制Na7K+-ATPasePl亚基的降解。通过逐步截短NDRG2，发明人筛选 并发现NDRG2第141-239片段中，包含两种蛋白相互作用的关键位点（图3)。为进一步明确运 99个氨基酸中与NDRG2相互作用的最重要的肤段，发明人将运99个肤段进一步截短，得到：
[0029] NDRG2i41-16〇，NDRG2i61-18〇，NDRG2i81-2。。，NDRG2201-220和 NDRG2221-239。
[0030] 实施例2:TAT-NDRG2i41-16〇的构建及筛选
[0031] I.发明人将NDRG2蛋白141-239肤段截短并连接TAT穿膜肤段：
[0032] TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239 0
[0033] 2.WTAT-NDRG2141-16日融合肤的构建方法为例，各融合肤段的制备方法和步骤如 下：
[0034] (A)称取Ig氯树脂于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡；
[0035] (B)2小时后，用DMF洗涂树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；
[0036] (C)称取182mg化OC-Asn(化t)-〇H(根据树脂取代度计算）于IOml的离屯、管中，加 入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀Imin,待溶液澄清后加入到反应器中， 然后将反应器置于30°C的摇床中反应；
[0037] (D) 2小时后，用IOML的甲醇封头（甲醇:DIEA: DCM= 1:1:2)半小时，然后用DMF洗涂 四次，抽干待用；
[003引化）向反应器中加入20ML的20 %赃晚（赃晚/DMF = 1: 4)，放在脱色摇床上摇晃 20min，W此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涂四次，然后抽干；
[0039] (F)取少量树脂用巧S酬法检测（检A(巧S酬）、检B(化晚）各两滴，100°C反应 Imin),树脂有颜色，说明脱保护成功；
[0040] (G)称取一定量的Fmoc-Ser(tbu)-〇H和册BT于IOml的离屯、管中，加入5m的DMF将其 溶解，然后加入0.5ml的DI讶辰荡摇匀Imin,待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置 于30 °C的摇床中反应；
[0041 ] (H) 1小时后，取少量树脂检测，用巧S酬法检测（检A、检B各两滴，10 (TC反应 Imin )，若树脂为无色，说明反应完全，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；
[0042] (I)待反应完全后，用DMF洗涂树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20% 赃晚(赃晚/DMF= 1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，W此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱 完保护后用DMF洗涂四次，然后抽干检测保护是否脱去；
[0043] (J)按照步骤(G)-(I)依次接上剩余氨基酸；
[0044] 化)脱去最后一个氨基酸Y的保护后，用切割试剂切割下肤链冻干，送纯化用高效 液相色谱进行纯化分离；
[0045] (L)待纯化制备检测纯度大于99%可进行使用；
[0046] (M)-20°C保存制备好的粉剂，使用时准确称量，溶解于生理盐水中，离体实验浓度 为20iiM，在体实验浓度为lOmg/kg。
[0047] 2.在细胞水平利用免疫共沉淀的方法证实:体外培养的原代星形胶质细胞分别用 TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-2。。，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239 五种 融合肤处理，TAT-NDRG2141-160处理组内源性NDRG2与化7K+-ATPasef31亚基相互作用被明显 阻断（图4)，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2i8i-2〇o，TAT-NDRG22〇i-22〇，TAT-NDRG2221-239处理组没 有明显的阻断效应。
[004引 3. TAT-NDRG2141-160处理星形胶质细胞后，融合肤可通过与化Vr-ATPasem的结合 和相互作用，提高NaYr-ATPasePl蛋白的稳定性（图5)。
[0049] 实施例3:TAT-NDRG2i"-16〇的药效学实验
[0050] 1.细胞实验:对离体培养的原代星形胶质细胞分别用TAT-Ctrl(对照乱序融合肤） 和TAT-NDRG2141-160处理后，给予200iiM剂量的FITC-Glu(即FITC标记的谷氨酸)进行处理，采 用活细胞工作站进行图像采集，检测两种肤段对星形胶质细胞再摄取谷氨酸的能力影响， 发现TAT-NDRG2141-160处理后，星形胶质细胞再摄取谷氨酸的能力明显增强（图6)。
[0051] 2.在体实验:给小鼠进行大脑中动脉闭塞(MCAO)手术，模拟急性缺血性脑卒中，缺 血1小时后，拔取线栓、恢复脑血流，同时经锁骨下静脉分别注射TAT-Ctrl和TAT-NDRG2141-160。再灌注24小时后，微透析获得小鼠纹状体部位的脑外液样本，册LC分析表明， 与对照肤段TAT-Ctrl相比，TAT-NDRG2141-16日可W明显降低小鼠脑细胞外液谷氨酸水平（图 7)，TAT-NDRG2141-16日处理组小鼠脑梗死体积明显减少（图8)。人工合成小分子融合肤TAT-NDRG2141-160用于治疗缺血性脑卒中药效确切，有良好的应用前景。
【主权项】
1. 一种多肽，该多肽的序列如SEQ NO 1所示。2. 权利要求1所述多肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。3. 权利要求1所述多肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。4. 一种融合肽，其特征在于，该融合肽包括穿膜肽和权利要求1所述多肽，所述穿膜肽 为TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。5. -种融合肽，其特征在于，该融合肽的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。6. 权利要求4或5所述融合肽用于促进星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的应用。7. 权利要求4或5所述融合肽用于制备治疗缺血性脑卒中药物的应用。
【文档编号】A61K47/42GK105837679SQ201610284885
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】李燕, 尹安琪, 郭航, 熊利泽
【申请人】中国人民解放军第四军医大学